用于定向輸送Rspo1來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于定向輸送Rspol來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞及其應用，尤其涉及一種Rspol基因轉染間充質干細胞株修復載體及其在修復腸上皮輻射損傷中的應用，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002]隨著核工業(yè)的發(fā)展，核科學技術的廣泛應用以及核恐怖襲擊的威脅，如何救治急性輻射損傷成為了當今迫切的需求。腸道對電離輻射十分敏感，腸上皮結構和功能受損是急性輻射性病難以救治的關鍵因素之一。腸隱窩干細胞及其干細胞龕遭受嚴重破壞，是腸隱窩-絨毛更新障礙的根本原因，是腸上皮結構和功能放射性損傷的關鍵病理機制。
[0003]間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一群來源于中胚層，異質性很強的具有自我更新能力的多能干細胞，能分化為脂肪細胞，成骨細胞，軟骨細胞，肝細胞，神經元細胞，肌細胞，上皮細胞等細胞。大量研宄表明，間充質干細胞可趨化至受傷發(fā)炎的部位，具備潛在的免疫調節(jié)能力，抗炎能力和營養(yǎng)作用，是組織工程，再生醫(yī)學和自身免疫性疾病治療的理想工具。
[0004]Rspol (R-spondinl)屬 R-spondin(roof plate-specific spondin)家族成員，是新近發(fā)現(xiàn)的一種可溶性分子，由263個氨基酸殘基組成，含有I個I型凝集酶樣結構域(thrombospondin type I motif)和 2 個弗林蛋白酶樣結構域(furin like domain)，是參與脊椎動物的生長發(fā)育的重要因子，表達于腸道、胰腺和腎上腺、性腺、前列腺、腎臟以及腦等組織。新近發(fā)現(xiàn)，Rspol可通過調節(jié)腸上皮干細胞β-catenin活化信號，促進腸隱窩干細胞增殖和分化，恢復腸絨毛和腸隱窩結構的完整性。給予外源性Rspol可提高腸上皮的修復能力，減輕炎癥因子和活性氧自由基等病理因素對腸道粘膜的損傷。而間充質干細胞不僅具備良好的免疫抑制功能，可減輕局部組織的炎性損傷，而且具有向組織損傷部位迀移的特點。另外，人Rspol可作用于小鼠腸隱窩干細胞，產生促增殖、分化和生存作用。
[0005]因此，如何將間充質干細胞與Rspol結合并應用于因核輻射帶來的腸上皮結構和功能損傷，成為當前亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于定向輸送Rspol來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞，該間充質干細胞通過將C3H10 T1/2的免疫抑制作用和Rspol促增殖與分化作用聯(lián)合，能夠定向修復福射性損傷的腸上皮。
[0007]本發(fā)明的技術方案是:
[0008]—種用于定向輸送Rspol來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞的構建方法，包括下述步驟:
[0009](I)重組逆轉錄病毒表達載體的制備:設計并合成引物對，其中上游引物的序列為SEQ ID: 1，下游引物的序列對為SEQ ID: 2，以人Rspol全長cDNA序列為模板，采用高保真酶KOD-neo plus通過PCR擴增得到PCR產物，對逆轉錄病毒載體pEGZ-Term和經回收純化的上述PCR產物采用限制性內切酶EcoRI和BamHI進行雙酶切，采用T4DNA連接酶連接再次經純化后的產物，轉化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，并挑選陽性菌落，然后抽提質粒，并將該抽提出的質粒命名為pEGZ-Term/Rspol，建構得到重組逆轉錄病毒表達載體pEGZ-Term/Rspol ；
[0010](2)重組逆轉錄病毒的制備:將293T細胞以IX1Vml密度接種六孔板中，待細胞豐度達80 %?90 %時，用脂質體轉染法將重組質粒pEGZ-Term/Rspol、輔助病毒載體PHIT456和pHIT60同時導入293T細胞，獲得具有感染能力的重組逆轉錄病毒；分別于48h和96h收集培養(yǎng)病毒上清備用；
[0011](3) Rspol基因轉染間充質干細胞株的構建:將(2)中收集所得病毒上清0.5ml加入含有 10% FCS 的 RPM1640 培養(yǎng)基 0.5ml，并按 8 μ g/ml 添加 Polybrane,按 2X 104/ml 混懸小鼠間充質干細胞C3H10 T1/2，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，消化C3H10 T1/2細胞并按0.5 X 104/ml重懸細胞，按Iml/孔接種于24孔板，按0.5 μ g/ml G418加壓篩選，待克隆長至足夠大后擴大培養(yǎng)，命名為C3H10/Rspol，獲得Rspol基因轉染間充質干細胞株C3H10/Rspolo
[0012]其進一步的技術方案是:
[0013]步驟(I)中所述上游引物帶有EcoRI酶切位點，所述下游引物帶有BamHI酶切位點和His標簽。
[0014]步驟(I)中所述PCR擴增條件為:預變性95°C，3min ;變性98°C，1s ;復性與延伸68°C, 40s ;擴增30個循環(huán)；最后延伸68°C，5min。
[0015]本發(fā)明還公開了一種上述構建方法構建所得的用于定向輸送Rspol來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞C3H10/Rspol。
[0016]其進一步的技術方案是:
[0017]所述C3H10/Rspol能夠穩(wěn)定表達人Rspol蛋白質分子，并能夠將該人Rspol蛋白質分子靶向迀移至腸道受損傷部位。
[0018]所述C3H10/Rspol的上清液中的的Rspol蛋白質分子具有生物活性。
[0019]本發(fā)明還公開了所述的用于定向輸送Rspol來修復放射性腸上皮損傷的間充質干細胞的用途，所述C3H10/Rspol用于制備靶向保護和修復核輻射引起的腸道上皮損傷用藥物或制劑。
[0020]其進一步的技術方案是:
[0021]小鼠間充質干細胞C3H10 T1/2能夠表達CXXR4趨化因子受體的特性在定向趨化至受核輻射引起的腸上皮輻射損傷部位的應用。
[0022]小鼠間充質干細胞C3H10 T1/2能夠表達PD-L1、B7H3、B7H4、TGF-β負性膜分子和分泌TGF- β、IL-1O和PGE2免疫抑制分子的特性在抑制輻射損傷后的細胞因子風暴和繼發(fā)性反應的應用。
[0023]人Rspol蛋白質分子在促進腸隱窩干細胞增殖和分化上的應用。
[0024]借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點:本發(fā)明利用腸上皮輻射損傷小鼠模型，通過將小鼠間充質干細胞C3H10 Τ1/2的免疫抑制作用和人Rspol分子促增殖與分化作用聯(lián)合，用來定向修復輻射性損傷的腸上皮，為制備急性放射病的過程中修復腸上皮結構和功能的藥物或制劑提供了良好的基礎。
[0025]上述說明僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0026]圖1是不同輻照劑量小鼠的生存曲線；
[0027]圖2是輻照后小鼠體征變化；
[0028]圖3是輻照后小鼠體重變化；
[0029]圖4為輻照后不同天數(shù)小腸形態(tài)的改變；
[0030]圖5為輻照后不同天數(shù)小腸長度的改變；
[0031]圖6為輻照后不同天數(shù)小腸病理形態(tài)的改變HE染色1X和20X放大圖；
[0032]圖7為輻照后不同天數(shù)小腸絨毛長度與隱窩個數(shù)比較示意圖；
[0033]圖8為輻照后不同天數(shù)小腸隱窩內Lgr5+干細胞的變化；
[0034]圖9為輻照后不同天數(shù)小腸隱窩干細胞數(shù)量的比較；
[0035]圖10 為重組表達載體 Pegz-Term/Rspol 的構建，其中 M:DL2000 DNA marker ；1:pEGZ-Term/Rspol重組載體；2:pEGZ-Term/Rspol重組載體采用EcoRI和BamHI雙酶切后的產物；3:人Rspol全長基因經PCR擴增后的產物；
[0036]圖11 為 RT-PCR 檢測 C3H10/Rspol 細胞中 Rspol mRNA 的表達，其中 A:M:DL2000DNA marker ；1:pEGZ-Term/Rspol 重組載體；2:C3H10/Rspol ；3:C3H10/mock ；4:C3H10Tl/2 ；B:M:DL2000 DNA marker ；1:C3H10/Rspol ；2:C3H10/mock ；3:C3H10 Tl/2 ；
[0037]圖12為C3H10/Rspol細胞表達His-Rspol融合蛋白的結果圖；
[0038]圖13為SW480細胞表面表達Rspol受體Lgr5 ；