無載體固定化米根霉脂肪酶及其制備方法和生產(chǎn)生物柴油的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及無載體固定化脂肪酶及其制備方法和應(yīng)用，尤其是無載體固定化米根 霉脂肪酶及其制備方法和生產(chǎn)生物柴油的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1.3)，即三?；视王；饷福且活惣瓤梢源呋椭?水解又可以進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的酶。脂肪酶廣泛存在于許多動(dòng)植物及微生物中，尤其在微生 物中有著廣泛的分布。目前已知有細(xì)菌、放線菌、酵母、絲狀真菌共計(jì)65個(gè)屬的微生物產(chǎn)脂 肪酶。絕大多數(shù)脂肪酶可以用來催化油脂水解，但只有部分脂肪酶可以用來催化油脂的轉(zhuǎn) 酯化反應(yīng)。脂肪酶水解油脂后生成游離脂肪酸和甘油、甘油單酯或二酯，其轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)則是 催化甘油三酯與短鏈醇之間的酯交換反應(yīng)，生成甘油酯和單鏈脂肪酸酯（即生物柴油）的 過程。由于脂肪酶催化反應(yīng)高效、反應(yīng)條件溫和且無毒副產(chǎn)物，所以作為一種重要的工業(yè)用 酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、皮革工業(yè)、洗滌工業(yè)、醫(yī)藥飼料工業(yè)及生物能源等方面。
[0003] 與液體脂肪酶相比，載體固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易于控制和分離、便于運(yùn)輸 和貯存、可實(shí)現(xiàn)反復(fù)多次使用并且有利于自動(dòng)化生產(chǎn)等明顯優(yōu)勢(shì)。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)CN104087571A以含氫硅油疏水改性的二氧化硅為載體固定脂肪 酶，在具有較高催化活力及良好穩(wěn)定性的條件下，其重復(fù)使用性得到有效提高，重復(fù)使用12 次以后，酶活力仍能保持最初的80%以上。
[0005] 中國(guó)專利申請(qǐng)專利CN103882004A以纖維素生物質(zhì)碳化成生物炭基質(zhì)，采用油酸 分子修飾的納米凝膠對(duì)生物炭基質(zhì)表面包被，包被后的生物炭基質(zhì)與脂肪酶溶液接觸進(jìn)而 對(duì)脂肪酶進(jìn)行界面活化與交聯(lián)固定，冷凍干燥后獲得固定化脂肪酶，該方法進(jìn)行處理的脂 肪酶的催化活性得到大幅度的提高。
[0006] 美國(guó)專利申請(qǐng)US5817493利用脂肪酶與含有不可水解有機(jī)物成分之間的Si-C化 學(xué)鍵將酶分子固定在一種硅基質(zhì)上，實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的穩(wěn)定高效催化和重復(fù)利用。
[0007] 美國(guó)專利申請(qǐng)US5508185使用酸性溶液溶解低分子可溶的殼聚糖形，然后使這種 殼聚糖與一種多元醇的縮水甘油醚和酸鹵化物反應(yīng)形成一種多孔的固定化酶載體，脂肪酶 分子通過共價(jià)結(jié)合與這種載體交聯(lián)，獲得了比游離脂肪酶高出50-60倍的催化效率。
[0008] 目前研宄開發(fā)出的這些載體固定化脂肪酶通常具有穩(wěn)定性好、回收率高和可重復(fù) 使用等優(yōu)點(diǎn)，但是不能很好地滿足機(jī)械強(qiáng)度高、價(jià)格低且易于制備和活化的要求。
[0009] 基于此，技術(shù)人員一直在致力于研宄新的脂肪酶固定化方法，以彌補(bǔ)上述不足。
[0010] 中國(guó)專利申請(qǐng)CN102154256A公開了一種無載體固定化脂肪酶的制備方法，將擴(kuò) 展青霉脂肪酶（PEL-CLEA)在硫酸銨沉淀后利用交聯(lián)劑戊二醛把酶分子交聯(lián)聚集，來實(shí)現(xiàn) 脂肪酶固定化目的。這種無載體固定化脂肪酶雖然具有成本低、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，但是效率 和可重復(fù)使用性表現(xiàn)較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種無載體固定化米根霉脂肪酶及其 制備方法和應(yīng)用，通過本發(fā)明的制備方法得到的無載體固定化米根霉脂肪酶成本低、催化 效率和可重復(fù)使用性表現(xiàn)優(yōu)異，特別適用于生物柴油的制備。
[0012] 本發(fā)明提供的無載體固定化米根霉脂肪酶的制備方法包括以下步驟：
[0013] 1)將蛋白交聯(lián)助劑加入含米根霉脂肪酶的緩沖液中以形成第一溶液，所述蛋白交 聯(lián)助劑為血清白蛋白；
[0014] 2)向步驟1)得到的第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶進(jìn)行沉淀， 靜置后得到含米根霉脂肪酶沉淀的第二溶液；
[0015] 3)向步驟2)制得的第二溶液加入交聯(lián)劑以形成混合溶液，然后將該混合溶液孵 育，其中，所述交聯(lián)劑選自乙酸酐、甲醛和戊二醛；
[0016] 4)將步驟3)孵育后的混合溶液進(jìn)行沉淀以得到交聯(lián)酶聚體，即為無載體固定化 米根霉脂肪酶。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，優(yōu)選地，步驟1)中，所述米根霉脂肪酶為米根霉脂 肪酶基因轉(zhuǎn)化表達(dá)培養(yǎng)液的凍干粉，所述米根霉脂肪酶轉(zhuǎn)化表達(dá)培養(yǎng)液通過將米根霉脂肪 酶基因轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體上培養(yǎng)表達(dá)而得。
[0018] 所述米根霉脂肪酶的上述來源為一種優(yōu)選來源，也可以為現(xiàn)有技術(shù)中的已有產(chǎn) 品。上述米根霉脂肪酶基因優(yōu)選為米根霉Rhizopusoryzae IFO 4697的脂肪酶ROL的基 因，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化過程中，使用EcoRI和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)將ROL基因連接到載體上。利用 該基因轉(zhuǎn)化表達(dá)而制備米根霉脂肪酶的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式為：提取Rhizopusoryzae IFO 4697的總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增cDNA上的脂肪酶ROL的基 因，然后使用EcoRI和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)將ROL基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α上 面，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母Pichia pastoris Χ33胞內(nèi)重組表達(dá)。在含橄欖油的培養(yǎng)基上挑 取確定有脂肪酶表達(dá)的菌落進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)；收集含有脂肪酶的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)液， 然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行凍干處理；所述凍干粉即為米根霉脂肪酶凍干粉。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，優(yōu)選地，步驟1)中，每毫升緩沖液中含有的米根霉 脂肪酶為30~70mg，所述米根霉脂肪酶與所述蛋白交聯(lián)助劑的質(zhì)量比為5~20:1。
[0020] 血清白蛋白，即Serum albumin，?？s寫為ALB，是脊椎動(dòng)物血漿中含量最豐富的球 蛋白。優(yōu)選為牛血清白蛋白（BSA)，其含607個(gè)氨基酸殘基，分子量為66. 446kDa，等電點(diǎn)為 4.7。血清白蛋白可以在米根霉脂肪酶轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中降低醇對(duì)于脂肪酶酶活的影響。每毫 升緩沖液中溶入的脂肪酶更優(yōu)選為40~60mg，進(jìn)一步優(yōu)選為45~55mg，所述脂肪酶與所 述蛋白交聯(lián)助劑的重量比更優(yōu)選為6~15:1，進(jìn)一步優(yōu)選為8~12:1 ;所述緩沖液優(yōu)選為 磷酸鹽緩沖液（K2HPO4-KH2PO4)，優(yōu)選的濃度為50mM，pH = 7. 0 (米根霉脂肪酶最適pH)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，步驟2)中，乙二醇二甲醚的滴加體積與步驟1)中所 述緩沖液體積的比值為1~3:1，優(yōu)選為1. 5~2. 5:1。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，步驟2)中，4°C條件下攪拌的 同時(shí)逐滴加入乙二醇二甲醚進(jìn)行脂肪酶的沉淀，靜置20-50min。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，優(yōu)選地，步驟3)中，所述交聯(lián)劑以20~60% (v/v) 的交聯(lián)劑水溶液加入，所述交聯(lián)劑的終濃度為15~40mM。
[0024] 步驟3)中，更優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑水溶液的濃度為25 %~50 % (v/v)，進(jìn)一步優(yōu)選 為30%~40% (v/v);所述交聯(lián)劑的終濃度更優(yōu)選為20~30mM ;將混合溶液放入搖床中孵 育的優(yōu)選條件為：36~38°C搖床中150~250rpm孵育3~5h。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，優(yōu)選地，步驟4)中，沉淀得到交聯(lián)酶聚體的方法為： 加入丙酮沉淀，離心除去上清液，再用丙酮洗沉淀而得。
[0026] 步驟4)中，丙酮的加入量與步驟1)中所用緩沖液的體積比為0. 5~3:1，更優(yōu)選 為0. 7~1. 5:1。優(yōu)選地，用丙酮多次清洗沉淀。
[0027] 上述方法制得的交聯(lián)酶聚體即為本發(fā)明的無載體固定化米根霉脂肪酶。
[0028] 本發(fā)明提供的所述無載體固定化米根霉脂肪酶的應(yīng)用涉及脂肪酶在食品工業(yè)、皮 革工業(yè)、洗滌工業(yè)、醫(yī)藥飼料工業(yè)及生物能源等方面各種用途，特別涉及在制備生物柴油中 的應(yīng)用。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明所述的無載體固定化米根霉脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用，優(yōu)選 地，原料為油脂和醇，制備生物柴油的原料為油脂和醇，所述油脂和醇在所述無載體固定化 米根霉脂肪酶催化作用下發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)而生成生物柴油。
[0030] 所述油脂可以為動(dòng)物油脂、植物油脂或微生物油脂，也可以為混合油脂和廢棄油 月旨。根據(jù)本發(fā)明所述的無載體固定化米根霉脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述 無載體固定化米根霉脂肪酶與所述油脂的質(zhì)量比為0. 3~3 :1，更優(yōu)選為0. 5~2:1，所述 醇包括甲醇和叔丁醇。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明所述的無載體固定化米根霉脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用的一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方式，操作步驟如下：將油脂和甲醇以醇油摩爾比為2~5:1的比例進(jìn)行混合，溶 解于其混合溶液1~4倍體積的叔丁醇中，加入上述無載體固定化脂肪酶，搖床中反應(yīng)。反 應(yīng)中期可以加入與初始添加量相同的甲醇。10~30h(進(jìn)一步優(yōu)選為12~24h)反應(yīng)結(jié)束后 將混合溶液置于分液漏斗中靜置分層，取上層相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，使生物柴油與甲醇和叔 丁醇分離，將蒸餾后的生物柴油置于分液漏斗中收集。其中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的溫度控制在63~68°C (例如為 65°C )。
[0032] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的方法制備的無載體固定化米根霉脂肪酶催化油脂 轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)較強(qiáng)，可以用來作為生產(chǎn)生物柴油較為理想的酶制劑。此外，本發(fā)明大大增加 了在生物柴油制備過程中脂肪酶在甲醇溶液中的穩(wěn)定性，并且固定化酶的重復(fù)利用率顯著 提高。這些有益的效果有賴于本發(fā)明的無載體固定化米根霉脂肪酶的制備方法的整體優(yōu) 化，其中涉及的重要技術(shù)手段舉例如下：使用BSA作為蛋白交聯(lián)助劑和保護(hù)劑，大大增加了 在生物柴油制備過程中脂肪酶在甲醇溶液中的穩(wěn)定性，并且固定化酶的重復(fù)利用率顯著提 高；該固定化酶制備方法使用乙二醇二甲醚作為沉淀劑使脂肪酶充分沉淀，比常規(guī)使用硫 酸銨沉淀效果更好，能夠保持酶活性90%以上；以乙酸酐、甲醛或戊二醛作為交聯(lián)劑將脂 肪酶交聯(lián)固定化，與傳統(tǒng)固定化酶方法相比優(yōu)勢(shì)明顯，無需使用固定載體，制備過程簡(jiǎn)單。
【附圖說明】
[0033] 圖1為使用實(shí)施例2制得的固定化脂肪酶重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并 不限于此。
[0035] 材料和條件說明如下：
[0036] 米根霉 Rhizopusoryzae IFO 4697 和畢赤酵母 Pichia pastoris X33 都為科學(xué)研 宄領(lǐng)域流通使用的菌種，在我國(guó)本領(lǐng)域相關(guān)的主要科研單位（例如福建師范大學(xué)）都能獲 得并進(jìn)行培養(yǎng)。文獻(xiàn)中也經(jīng)常提及，例如如下文獻(xiàn)：Ting Sun, Wei Du, Dehu