水稻苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子POscold7的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是全球重要的糧食作物之一，低溫會引起水稻減產(chǎn)，世界水稻主產(chǎn)區(qū)普遍存 在的問題便是低溫冷害的問題。在水稻發(fā)育的不同時期發(fā)生冷害均會對水稻造成不同程度 的損害。在苗期發(fā)生冷害會造成秧苗失綠、發(fā)僵、分蘗減少、枯萎等現(xiàn)象，嚴(yán)重時會發(fā)生死 苗；孕穗期發(fā)生冷害會使花藥發(fā)育不完全，造成水稻減產(chǎn)；開花盛期發(fā)生冷害會導(dǎo)致水稻 不能正常散粉或花粉管的正常萌發(fā)受到影響，從而導(dǎo)致結(jié)實率下降。每年全球因低溫傷害 造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元，因此如何克服低溫傷害，培育抗低溫的基因工程作物 是作物分子設(shè)計育種的關(guān)鍵。
[0003] 植物中存在著一個復(fù)雜的低溫脅迫信號應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。植物在受到低溫脅迫后能 通過該系統(tǒng)進(jìn)行一系列的基因遺傳修飾，對自身的代謝和生長進(jìn)行調(diào)節(jié)以適應(yīng)該不利因素 對其造成的影響。利用這一應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因，可以有效提高植物對低溫的耐受性。仲 康等（2007)將鋅指蛋白類似蛋白OsCOIN基因在水稻中過量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因水稻中脯氨酸含 量升高，提高植物的耐冷性。張紅生等（2009)將水稻鋅指蛋白ZFP245基因在水稻中過量 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)ZFP245基因水稻在冷脅近下使脯氨酸積累相關(guān)基因0sP5CS和脯氨酸 轉(zhuǎn)運基因 OsProT基因的表達(dá)量提高，促使脯氨酸的量增加，增強植物的耐冷性。余淑美等 (2010)發(fā)現(xiàn)MYBS3超量表達(dá)水稻能在4°C下處理以后可以存活，且不影響其主要農(nóng)藝性狀。 另外，對一些包括DREB/CBF、NAC等轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)可以提高水稻的耐冷性。
[0004] 我國水稻資源豐富，從水稻中發(fā)掘、定位、克隆耐冷相關(guān)基因及其冷誘導(dǎo)啟動子， 將對水稻耐冷品種的選育具有重要的理論及實際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市 場前景。但是，目前即便在世界范圍內(nèi)，這樣的可利用遺傳資源也并不是很多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在冷誘導(dǎo)條件下特 異性表達(dá)的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應(yīng)用。其中，本文中所 涉及的"植物"是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子 P0scold7,其特征在于，包含：
[0007] (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0008] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的且 具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0009] (C)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的且 具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0010] (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的且具有 啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0011] (e)與SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有啟動子功 能的核苷酸序列；或者
[0012] (f)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列雜交且具有啟動子功能的 核苷酸序列；
[0013] (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者
[0014] (h)與SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有啟動子功 能的核苷酸序列；或者
[0015] (i)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的且 具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0016] (j)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的且 具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0017] (k)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的且具 有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0018] (1)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列雜交且具有啟動子功能的 核苷酸序列。
[0019] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列為從日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)擴增并提取出的水稻冷誘導(dǎo)強表達(dá)啟動子，本文中稱為P0scold7 或啟動子P〇scold7。具體而言，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1985bp的DNA序列，具有驅(qū)動目標(biāo)基因 在寒冷條件下特異性表達(dá)的功能，該啟動子可以在水稻苗期即發(fā)揮其作用，因此本發(fā)明的 發(fā)明人分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供一種擴增上述水稻苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子P〇SC〇ld7的全 長或其任意片段的引物對。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述植物冷誘導(dǎo)強表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0022] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的水稻 苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子P0sc〇ld7,在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻苗期冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動 子P0sc〇ld7連接于待表達(dá)的基因序列的上游。優(yōu)選的，所述待表達(dá)的基因為Gus基因，所 述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1391-P0scold7,該重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:l所示的序列 即P0scold7或啟動子P0scold7構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為 pCAMBIA1391-P0sc〇ld7?；蛘叽磉_(dá)基因可以為任何對作物的耐寒性具有改善功能的基 因。通過本發(fā)明的啟動子驅(qū)動該耐寒基因在寒冷條件下表達(dá)，從而實現(xiàn)改善作物耐寒性狀 的功能。
[0023] 再一方面，本發(fā)明提供上述植物冷誘導(dǎo)強表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng) 用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述植物冷誘導(dǎo)強表達(dá)啟動子連接于載體的待表達(dá)的基 因序列上游（例如，將所述啟動子序列插入目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載體，將所 述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0024] 并且優(yōu)選地，所述應(yīng)用可以用于改良植物生長特性，所述植物為單子葉植物，例如 水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0025] 需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，SEQ ID No :2中的序列為去除了 SEQ ID No :1中開頭的22bp以及結(jié)尾的22bp后的序列，為獲自日本晴水稻中的DNA序列。SEQ ID No :1中開頭的22bp為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列；SEQ ID No :1中結(jié) 尾的22bp為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相 應(yīng)序列互補）。需要強調(diào)的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整個DNA序列，也可以 指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的是，即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的 基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0026] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻P0sc〇ld7基因上游包 括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1985bp的DNA序列，并將其命名為啟動子P0sc〇ld7。將該序列經(jīng)酶 切后連接到植物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體）， 利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化， 得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Gus表達(dá)定量檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在低 溫誘導(dǎo)處理后，整體上的Gus基因表達(dá)水平提高，從而證明該1985bp的序列具有驅(qū)動基因 表達(dá)的活性，而且該啟動子驅(qū)動的Gus基因在水稻低溫誘導(dǎo)處理后表達(dá)。
[0027] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，在低 溫誘導(dǎo)處理后可驅(qū)動靶標(biāo)基因在植株中在水稻苗期時即可特異性表達(dá)，從而提高外源靶標(biāo) 基因在植物中的表達(dá)量，增加轉(zhuǎn)基因的效果。
[0028] 技術(shù)效果
[0029] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子P0scold7能夠調(diào)控基因在植株中集中表達(dá)，在實際 應(yīng)用中具有顯著價值。利用該啟動子能顯著提高水稻的耐寒性能，這對于水稻耐冷性分子 機制的研宄以及培育耐寒性的水稻新品種具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
[0030] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0031] 圖1為將P0scold7啟動子構(gòu)建于pCAMBIA391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中 A為pCAMBIA1391示意圖，圖1中B為pCAMBIA1391-Poscold7示意圖，其中示出了利用 P0scold7啟動子驅(qū)動位于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0032] 圖2為對本發(fā)明啟動子進(jìn)行酶切驗證的結(jié)果示意圖；
[0033] 圖3為7天苗齡的P0scold7::⑶S轉(zhuǎn)基因植株組織染色圖。在30°C條件下正常生 長的水稻植株，經(jīng)24小時染色后，根、葉均無 Gus活性，而在4°C冷處理24小時后，再經(jīng)過 30min染色后，在根、莖、葉中均有Gus強烈表達(dá)。（標(biāo)尺=IOmm)
[0034] 圖4為冷處理他、111、411、811、1211、1611、2011、2411后？〇8(3〇1(17的相對表達(dá)量的變化。
【具體實施方式】
[0035] 以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0037] 含有酶切位點的POscold7啟動子的獲得
[0038] 步驟1、引物的設(shè)計
[0039] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因組 序列，依據(jù)水稻基因的序列設(shè)計擴增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點，設(shè)計引物 的酶切位點。
[0040] 本實驗例中以水稻雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391 (來自于CAMBIA，公開使用載體， 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心水稻組保存）為例，靶 標(biāo)基因為Gus基因，具體設(shè)計的引物為：正向引物（SEQ ID N〇:3)5'端帶BamHI，酶切位點 (GGATCC)，反向引物（SEQ ID No:4