一種莖瘤芥硫苷酶基因myr1、莖瘤芥硫苷酶及其基因工程表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于硫苷酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莖瘤芥硫苷酶基因 MYR1、莖瘤芥硫苷 酶及其基因工程表達方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 十字花科植物中有一種非常重要的防御酶即硫苷酶（Myrosinase)，也被稱為介子 酶；硫苷酶能降解硫苷，降解產(chǎn)物中包含葡萄糖、硫酸鹽、異硫代氰酸鹽、硫氰酸鹽等物質(zhì)； 其中異硫代氰酸鹽具有抗炎、預防癌癥等作用；硫苷酶常常以同工酶的形式存在，這些同工 酶由于糖基化的程度不同導致其物理性質(zhì)、化學性質(zhì)不同。目前發(fā)現(xiàn)，硫苷酶至少有3種類 型的編碼基因家族MA (Myrl，TGGl)、MB(Myr2, TGG2)、MC(Myr3, TGG3)，研宄表明MA基因家 族有4-5個基因，其編碼的硫苷酶是可溶性二聚物。MB基因家族包括10-15基因，MC基因 家族由5個基因組成，MB和MC基因家族編碼的硫苷酶是不可溶復合物。
[0004] 目前國際上對硫苷酶的性質(zhì)、提取方法做了很多研宄，對于硫苷酶的分離研宄首 先要提到Bjorkman等于1972年在白芥種子中提取了硫苷酶，并對其進行了純化；緊接著 Ohtsuru等對硫苷酶的提純方法和硫苷酶的性質(zhì)進行了研宄；Xian Li等人從辣根當中也 提取到了硫苷酶，并將其分離出來；Bones等在1989年從油菜幼苗當中分離得到硫苷酶；然 而植物中的硫苷含量通常比較低，直接提取并不能大量獲得硫苷酶。
[0005] 為更好地研宄硫苷酶的性質(zhì)，Chen and Barbara通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將硫苷酶基因克 隆到酵母中表達出來，但表達的酶對酵母有毒，不能大量表達。目前國內(nèi)學者主要從蘿卜、 油菜、擬南芥、芥菜、西蘭花中提取硫苷酶基因并構(gòu)建表達載體進行表達；比如2008年肖海 燕等從油菜中提取硫苷酶基因后構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并在大腸桿菌中誘導表達，得到90KDa 左右的蛋白條帶；2010年梁錦鋒等從西蘭花中提取硫苷酶基因并在畢赤酵母中表達，得到 65KDa大小的蛋白條帶；2012年張偉等人從甘藍型油菜中提取硫苷酶基因并構(gòu)建載體進行 表達；然而目前并未有從莖瘤芥中提取硫苷酶基因，并進行載體構(gòu)建表達莖瘤芥硫苷酶的 相關(guān)研宄。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種莖瘤芥硫苷酶基因 MYRl。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種莖瘤芥硫苷酶。
[0009] 本發(fā)明的再一個目的是提供上述莖瘤芥硫苷酶的基因工程表達方法。
[0010] 實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種莖瘤芥硫苷酶基因 MYR1，其核苷 酸序列為SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0011] 一種莖瘤芥硫苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示的序列。
[0012] 一種上述莖瘤芥硫苷酶的基因工程表達方法，包括如下步驟： 1) 取莖瘤芥葉片，提取總RNA ; 2) 以步驟1)提取的總RNA為模板，在PCR儀上通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成第一鏈cDNA ; 3) 比較油菜和芥菜硫苷酶基因的核苷酸序列，設(shè)計一對正反向引物，所述引物為： 上引物1 : 5' _ GATCCGGTTCTGGCGAATTCGACGACGACGACAAGGATGAAGAAATCAC -3' ； 上引物2 : 5' - CGACGACGACAAGGATGAAGAAATCACATGTGAAGAAAATAACC-3' ； 下引物： 5' -GGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTATTAAGCATCTGCGAAACGCTTCTTTTG -3' ； 4) 以步驟2)合成的第一鏈cDNA為模板，采用步驟3)所設(shè)計的引物，進行PCR反應(yīng)， 擴增獲得硫苷酶基因 MYRl的全長序列，所述硫苷酶基因 MYRl的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1 所示； 5) 提取載體PPIC9K-S質(zhì)粒，并用EcoR I和NotI雙酶切所述質(zhì)粒； 6) 將步驟4)獲得的硫苷酶基因 MYRl與步驟5)雙酶切后的表達載體雜交，獲得重組表 達載體 PPIC9K-S-MYR1 ; 7) 將步驟6)重組表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH10B，將轉(zhuǎn)化后的細胞在含氨芐 抗性的LB平板上于37°C培養(yǎng)18小時，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性克隆菌并測序； 8) 將步驟7)測序正確的陽性克隆培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，采用Sal I單酶切線性化處理，用 于畢赤酵母SMDl 168電轉(zhuǎn)化； 9) 將Sal I單酶切線性化處理的重組表達載體pPIC9K-S-MYRl，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母 SMD1168,涂布MD平板于30°C培養(yǎng)3-6天，并通過G418抗性，篩選得到遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化 子； 10) 挑取遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子的單克隆至Yro培養(yǎng)基培養(yǎng)，在28°C條件下，以300 rpm/ h的轉(zhuǎn)速振搖到0D600值為2-5之間，離心棄去上清液，向沉淀中加入BMMY液體培養(yǎng)基重懸 細胞；利用甲醇連續(xù)誘導表達，期間每24小時加甲醇至甲醇的終體積濃度為0. 5%以繼續(xù) 誘導，誘導72 h后，利用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析鑒定重組蛋白的表達。
[0013] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果： 1、莖瘤芥硫苷酶在莖瘤芥中的含量非常少，在莖瘤芥中直接提取硫苷酶具有一定的難 度，且天然硫苷酶具有糖基化修飾作用，原核表達產(chǎn)物缺乏硫苷酶活性，因此糖基化修飾對 于硫苷酶酶活性有很大影響；本發(fā)明選擇畢赤酵母為表達系統(tǒng)，在表達產(chǎn)物的加工、外分 泌、翻譯、修飾以及糖基化等方面具有很大的優(yōu)勢，且畢赤酵母具有醇氧化酶AOXl基因啟 動子，能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中快速生長，非常有利于莖瘤芥硫苷酶的純化。
[0014] 2、本發(fā)明比較油菜、芥菜等植物硫苷酶基因的核苷酸序列，選取同源性較高的區(qū) 域，設(shè)計一對正反向引物，以莖瘤芥的第一鏈cDNA為模板，擴增莖瘤芥的硫苷酶基因 MYRl， 并構(gòu)建重組表達載體口？扣91(-5-1^1?1，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母51?1168，將硫苷酶基因1^1?1克隆 到畢赤酵母表達載體中，表達得到莖瘤芥硫苷酶，分子量為90 KDa。
[0015] 3、本發(fā)明采用表達純化后的莖瘤芥硫苷酶，以Sinigrin黑芥子苷為底物，測定重 組蛋白的活性，結(jié)果表明在45°C下，重組子所表達的蛋白能夠水解硫苷，表現(xiàn)出硫苷酶的生 物活性，比活力約為〇· 〇3U/mL。
[0016] 4、本發(fā)明重組子可大量表達莖瘤芥硫苷酶，相比于直接提取的方法，本發(fā)明更具 有經(jīng)濟價值，具有良好的市場推廣前景。
[0017]
【附圖說明】
[0018] 圖1為莖瘤芥葉總RNA電泳檢測圖； 圖2為硫苷酶基因的RT-PCR擴增圖； 圖3為莖瘤芥硫苷酶基因序列BLASTX圖； 圖4為莖瘤芥硫苷酶氨基酸對比圖； 圖5為表達產(chǎn)物的SDS-PAGE圖； 圖6為純化后的融合蛋白電泳圖； 圖7為活性測定后檢測硫苷含量的HPLC圖。
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【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0021] 下述實施例中所米用的莖瘤芥（Brassica juncea (L. ) Czern. et Coss. var. tumida Tsen et Lee)為永安小葉，儲藏期為3年，由重慶市涪陵綠原農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司提 供；大腸桿菌DH10B，SMD1168工程菌，表達載體pPIC9K為NEB公司產(chǎn)品。
[0022] 無 RNase H20、滅菌石蠟油、IXTAE緩沖液、IXTBE緩沖液、平衡緩沖液、洗脫緩沖 液、6 X loading buffer、GoldviewTM 核酸染料、RNase 抑制劑、dNTP Mix、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、 10 X PCR Buffer、MgCl2、DNA聚合酶和瓊脂糖購自上海生物工程有限公司。
[0023] 限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Not I為NEB公司產(chǎn)品。
[0024] 所用其他原料如無特殊說明，即為普通市售。
[0025] 實施例1 莖瘤芥總RNA的提?。?在離心管中加入5 mL Trizol試劑，取0.5 g莖瘤芥葉片在液氮中快速研磨至粉末， 然后轉(zhuǎn)移到試管中，立即充分混勻，在室溫放置10 min后，在冷凍離心機中進行離心，溫度 設(shè)置為4°C，轉(zhuǎn)速為