阿維鏈霉菌rex基因在提高阿維菌素產(chǎn)量中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種提高阿維菌素產(chǎn)量的基因工程方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿維菌素（avermectins)是由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn) 生的一組高效殺蟲的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它的天然產(chǎn)物共有八個(gè)組分（Ala、Alb、 A2a、A2b、Bla、Blb、B2a和B2b)，其中BI組分的殺蟲活性最強(qiáng)，幾乎抗所有與農(nóng)業(yè)有關(guān)的線 蟲和節(jié)肢動(dòng)物，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上。伊維菌素（ivermectin)是以阿維菌素 Bl為原 料在C22-C23位加氫還原而成，與阿維菌素 Bl具有相同的殺蟲活性，但毒性比阿維菌素低 2-3倍，更適用于動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲的防治，是一類廣譜有效的新型抗寄生蟲抗生素。阿維 菌素和伊維菌素具有獨(dú)特的作用機(jī)制，不易使害蟲產(chǎn)生抗性，且易降解、無殘留，對作物、牲 畜、人類和環(huán)境高度安全，被我國農(nóng)業(yè)部推薦為無公害農(nóng)藥，具有非常廣闊的市場前景和應(yīng) 用價(jià)值。阿維菌素和伊維菌素已在國內(nèi)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。提 高阿維菌素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，通過基因工程手段改造阿 維鏈霉菌以提高阿維菌素的產(chǎn)量，具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 阿維鏈霉菌是一種好氧異養(yǎng)型放線菌，溶氧是鏈霉菌抗生素發(fā)酵過程中的重要參 數(shù)，常關(guān)系到抗生素發(fā)酵的成敗。因此，菌體細(xì)胞快速響應(yīng)氧化還原信號的變化對其生存及 抗生素發(fā)酵的成敗至關(guān)重要。在阿維菌素的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)阿維鏈霉菌對溶氧非常敏感， 發(fā)酵中前期短暫的供氧中斷常會(huì)造成阿維菌素產(chǎn)量大大降低或幾乎不能合成，這一現(xiàn)象在 阿維菌素高產(chǎn)菌株中尤其明顯。Rex不能直接感受環(huán)境中的氧信號，而是響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)NADH/ NAD+的比率變化。細(xì)胞內(nèi)的NAD (H)具有很高的周轉(zhuǎn)率，但當(dāng)細(xì)胞在限氧條件或有氧呼吸受 到抑制時(shí)，NADH/NAD+比率會(huì)迅速提高。當(dāng)細(xì)胞在限氧條件或有氧呼吸受到抑制時(shí)，NADH/ NAD+比率會(huì)迅速提高，體內(nèi)高水平的NADH可解除Rex與靶基因 cydAB⑶（編碼氧高親和性 的細(xì)胞色素 bd末端氧化酶）以及Rex-hemA⑶的結(jié)合，激活這些操縱子的表達(dá)以應(yīng)對氧氣 的匱乏。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高阿維菌素產(chǎn)量的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供高產(chǎn)阿維菌素和低氧耐受的基因工程菌。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供rex基因在提高菌種的阿維菌素產(chǎn)量中的 應(yīng)用。
[0007] 前述的應(yīng)用，即通過在菌種中缺失rex基因，以提高阿維菌素產(chǎn)量，該基因工程菌 株對于限氧條件更加耐受。
[0008] 所述菌種可以是任何能夠產(chǎn)生阿維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生菌，或者 經(jīng)常規(guī)誘變和基因工程改造后能夠產(chǎn)生阿維菌素的菌種。
[0009] 作為優(yōu)選，所述菌種為阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)。
[0010] 基于此，本發(fā)明提供一種缺失rex基因的產(chǎn)阿維菌素的基因工程菌。如前所述，其 出發(fā)菌可以是任何能夠產(chǎn)生阿維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生菌，或者經(jīng)基因工程 改造后能夠產(chǎn)生阿維菌素的菌種。
[0011] 作為優(yōu)選，其出發(fā)菌為阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述基因工程菌的制備方法為：構(gòu)建rex基因的缺失載體，并將該缺失 載體引入產(chǎn)阿維菌素的菌種中獲得rex缺失的重組菌。
[0013] 具體可通過如下方法構(gòu)建基因工程菌：用PCR擴(kuò)增阿維鏈霉菌中rex基因的上、下 游序列，構(gòu)建rex基因的缺失載體，并將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)阿維菌素菌株，篩選獲得 陽性重組菌。將含有缺失載體的菌株先在39°C高溫下培養(yǎng)誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失獲得單交換菌株， 再將其在28°C、無安普霉素的培養(yǎng)基下傳代進(jìn)行培養(yǎng)獲得rex基因缺失突變株。在本發(fā)明 實(shí)施例中，獲得了缺失rex的阿維鏈霉菌野生菌的基因工程菌。
[0014] 前述的方法，其中構(gòu)建rex基因缺失載體的出發(fā)載體為任意一種含有鏈霉菌溫度 敏感型復(fù)制子的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體。優(yōu)選穿梭載體為pKC1139、pGM160、pHZ132或 PCZA185 等。
[0015] 在本發(fā)明實(shí)施例中，以PKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建了 rex基因缺失載體pK⑶-rex。
[0016] 前述的方法中，所述將rex基因缺失載體引入產(chǎn)阿維菌素的菌種中，可以采用生 物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移法等，優(yōu) 選PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
[0017] 前述的方法中，為提高轉(zhuǎn)化效率，可先將rex基因缺失載體轉(zhuǎn)化到限制修飾作用 缺陷的大腸桿菌ET12567中，從中提取質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到產(chǎn)阿維菌素的菌種中。
[0018] 本發(fā)明提供一種提高阿維菌素產(chǎn)量的方法，其利用缺失rex基因的產(chǎn)阿維菌素的 基因工程菌來提高阿維菌素的產(chǎn)量。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明是將阿維鏈霉菌中編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子的rex基因通過缺失載體引入阿維 鏈霉菌中，獲得rex基因缺失的重組菌，使其不再合成Rex蛋白，從而提高阿維菌素的產(chǎn)量。 本發(fā)明的基因工程菌可直接用于阿維菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，提高阿維菌素的發(fā)酵單位，降低生 產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例rex基因缺失載體pK⑶-rex的質(zhì)粒圖譜。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例rex缺失載體pK⑶-rex與阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267染色體的同源雙交換示意圖。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267及其rex缺失突變株的 阿維菌素發(fā)酵單位。
[0024] 圖4為在不同發(fā)酵條件下，阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267及其rex缺失突變 株的阿維菌素發(fā)酵單位。圖中：*代表發(fā)酵時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為230rpm(正常搖床轉(zhuǎn)速為250rpm); **代表發(fā)酵至第五天時(shí)搖床停電兩小時(shí)后再恢復(fù)運(yùn)行。備注：柱狀圖上數(shù)字代表相應(yīng)處理 組與出發(fā)菌株相比阿維菌素產(chǎn)量下降的百分比。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 rex基因缺失載體的構(gòu)建
[0027] -、阿維鏈霉菌rex基因的克隆
[0028] 根據(jù)Genebank公布的阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267中rex基因 [NC_003155. 4(5777053. · 5777811)]的序列及其上、下游的序列設(shè)計(jì)PCR引物：
[0029] 引物 rex_l:5' -CCCAAGCTTCATCACCCAGGACGCGGAG-3，
[0030] 引物 rex_2 :5 ' -CGCGGATCCCTCGGAGGTACAGCGGAAGC-3'
[0031] 引物 rex_3:5，~CGCGGATCCTCACCTCCATCCTGAACTTCG~3r
[0032] 引物 rex_4 :5，~CCGGAATTCCCCTCGCCCACGACCATC~3'
[0033] 引物 rex_l、rex_2、rex_3 和 rex_4 兩端分別引入 HindIII，BamHI，BamHI 和 EcoRI 酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。以阿維鏈霉菌ATCC 31267基因組DNA為模板，分別以rex_l和 rex_2, rex_3 和 rex_4 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95°C，5min ;(95°C，50s ;60°C，50s ; 72°C，40s) X 29 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin ;25°C，lmin。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物，分別在 560bp (rex_l 和rex_2)和573bp(rex_3和rex_4)處有特異性的擴(kuò)增條帶，分別命名為上臂和下臂。
[0034] 二、rex缺失載體的構(gòu)建
[0035] 電泳回收上述片段，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，上臂和下臂分別經(jīng)Hindlll， BamHI 和 BamHI，EcoRI 酶切連接于經(jīng) HindIII 和 EcoRI 雙酶切的載體 pKCl 139 (Bierman M， Logan R，0'Brien K，等.用于從大腸桿菌到鏈霉菌DNA接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒克