插入片段做以下處理:用ddH20將靶位點的Oligo溶解為10 μ M，各取5 μ L等體積混勾，按以下程序進行退火:95 °C 5min，_1°C/30sec/cycle，to4V。
[0022]②連接體系:
取退火后的靶位點Oligo和SgRNA克隆骨架pT7-gRNA_汝《I各IuL跑膠，對插入片段和載體進行定量后，將退火后的靶位點01 igo與gRNA載體連接。因插入片段比較小，最終所定連接體系為:01igo I μ L，pT7-gRNA_ifesI I μ L, 5 X T4 ligase buffer 2 μ L，T4 ligaselyL，共1yL體系，25°C連接3~4h。取5 μ L，轉(zhuǎn)化到Trans-Tl感受態(tài)細胞中。
[0023]③菌落PCR驗證:
挑取5~10個單克隆到10 μ L LB液體培養(yǎng)基中，取I μ L用作模板進行PCR擴增，引物為載體通用引物RV-M和靶位點特異突變檢測引物R-eda，用EsayTaq DNA Polymerase，10 μ L體系進行擴增。目的條帶約130bp。挑取陽性克隆送測序，選取序列正確的克隆進行甘油保菌，提取質(zhì)粒。
[0024]⑷建立eda-sgRNA 模板:
以PCR法獲得sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄的模板，該模板序列如下:TAATACGACT CACTATA^nAGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaacttgaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt to
[0025]其中:斜體大寫部分為T7啟動子部分，下劃線部分為gRNA模板，小寫字母為sgRNA骨架。
[0026](5) sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄:
以PCR擴增產(chǎn)物I為模板，用T7 RNA聚合酶進行sgRNA體外轉(zhuǎn)錄，得到sgRNA ；sgRNA經(jīng)無水乙醇法沉淀后使其濃度為1000ng/ul。
[0027]其中:體外轉(zhuǎn)錄體系是指5XTranscript1n Buffer 10 μ L ；10Mm DTT 5 μ L ；NTP mix (1mM each) 10 μ L template (>1 μ g) 20 yL ；Τ7 RNA 聚合酶 2yL;RNaseInhibitor (40U) IyL DEPC 水補足體系到 50 μ L，37°C 反應(yīng) 2h，
取2 μ L用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。
[0028](6) Cas9 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄:
以U7驅(qū)動的人源化的Cas9編碼序列(Mali et al.，2013.Science,339(6121):823-6)為模板，用U7 RNA聚合酶進行Cas9體外轉(zhuǎn)錄，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA ；Cas9 mRNA經(jīng)無水乙醇法沉淀后使其濃度為600ng/ul。
[0029]其中:體外轉(zhuǎn)錄體系是指5XTanscript1n Buffer 10 μ L, 10mMDTT 5 μ L，NTPmix (ATP/CTP/UTP 各 10mM，GTP:1mM): 10 μ L SP6 RNA Polymerase (SOU) 2 μ L，RnaseInhibitor (SOU) I μ L，Template 17 μ L，CAP (1mM) 5 μ L0 37°C，水浴 1.5h。
[0030]取IyL進行1%瓊脂糖凝膠檢測mRNA合成效果。
[0031]①對Cas9 mRNA模板進行消化:加入DNasel 2 μ L，37°C消化15min0
[0032]②酚氯仿抽提及LiCl沉淀:
用DEPC水將Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄體系補足到100 μ L，加入酚:氯仿:異戊醇(25:24:I) 100 μ I,禍旋15s混勾，12000rpm離心30秒，吸取上清至新離心管中，加入氯仿:異戊醇(24:1) lOOyL，禍旋15s混勾，12000rpm離心30秒，再次將上清移至新離心管中，加入1/10體積的3 MNaAc (pH4.0)及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒，-80°C靜置5min。12000rpm離心15min，去除上清，在吸水紙上吸干，加入400 μ L Ua,顛倒混勻，12000rpm離心15min，吸取上清，加入700 μ L 70%DEPC乙醇，12000rpm離心15min，小心倒掉上清，再加Λ 700 μ L 70%DEPC乙醇，再次離心12000rpml5min，去除上清，室溫靜置3~5分鐘徹底揮發(fā)乙醇后溶于?ο μ L Rnase Free水中，取0.5 μ L用于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測gRNA濃度。
[0033](7)斑馬魚受精卵的顯微注射及突變檢測:
將sgRNA與Cas9 mRNA等量混合后，顯微注入到1~2細胞期的野生型斑馬魚受精卵，將注射后的斑馬魚胚胎放入28°C恒溫箱中培養(yǎng)。一般I μ L可以注射300顆卵。
[0034]待胚胎發(fā)育至24 hpf時，取5枚胚胎，制備基因組DNA模板，然后以突變檢測引物F-eda和突變檢測引物R-eda進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物II ;將所述PCR擴增產(chǎn)物II亞克隆到PEASY-T3載體中。并以T7和Sp6通用引物對轉(zhuǎn)化子進行擴增，將PCR產(chǎn)物十個一組共兩組直接送測序，測序引物為T7或Sp6其中一條。
[0035]TA克隆所用載體為pEASY-T3載體。具體步驟:
在0.2mL的EP管中加入以下反應(yīng)液第二輪PCR產(chǎn)物2 μ L，T4 DNA ligase I μ L，10XT4 DNA ligat1n buffer I μ L, pGM-T vector I μ L, ddH20 6 μ L，16°C連接過夜，第二天轉(zhuǎn)于Trans-Tl感受態(tài)細胞中。隨機挑取10個白色單菌落用T7和SP6通用引物進行菌落PCR，預(yù)期大小片段為350bp，將陽性克隆送天一輝遠進行測序。
[0036]⑶突變體鱗片發(fā)育觀察及染色鑒定:
對檢測有EDA基因突變的斑馬魚的鱗片發(fā)育情況進行顯微觀察，篩選獲得EDA基因外顯子4靶位點引入插入突變導(dǎo)致鱗片缺失突變體，對鱗片發(fā)育異常個體進行鱗片染色鑒定，以確定鱗片是否有發(fā)育缺陷。
[0037]具體步驟如下:用4%福爾馬林溶液進行固定24h，70%乙醇脫水5h，然后在lg/L的茜素紅溶液中進行染色24h，l%K0H+5%甘油進行脫色48h后，利用ZESIS Discovery V13顯微鏡進行成像。
[0038]實施例2該鱗片缺失斑馬魚模式的應(yīng)用于皮膚附件相關(guān)基因功能的驗證及外胚層發(fā)育不良藥物的篩選。
【主權(quán)項】
1.一種由Crispr/Cas9誘導(dǎo)的鱗片缺失斑馬魚模式，其特征在于:該模式是指包含EDA基因外顯子4位點堿基插入的鱗片缺失斑馬魚。2.如權(quán)利要求1所述的一種由Crispr/Cas9誘導(dǎo)的鱗片缺失斑馬魚模式的建立方法，包括以下步驟: ⑴利用Ensemble在線數(shù)據(jù)庫，查找斑馬魚EDA基因序列no:ENSDARG00000074591并下載，在該序列查找PAM序列即5 ’ -GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3 ’，在EDA基因外顯子找到的靶向作用序列為TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并設(shè)計突變檢測引物F_eda:ttgttttgcttctcatcagttg 和突變檢測引物 R-eda: tttgctctgctgcttcactc ； ⑵目標(biāo)序列的野生型等位基因的測序驗證: 隨機選取5枚24hpf野生型斑馬魚胚胎，提取基因組DNA模板，然后用F-eda和R_eda進行PCR擴增，得到片段長度為358bp的PCR擴增產(chǎn)物I，該PCR擴增產(chǎn)物I以所述突變檢測引物F-eda直接測序，以表明目標(biāo)基因組序列和數(shù)據(jù)庫中的序列一致，無SNP應(yīng)用重疊； ⑶構(gòu)建sgRNA: ⑷建立eda-sgRNA模板: 以PCR法獲得sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄的模板，該模板序列如下:TAATACGACT CACTATA^nAGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaacttgaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t ； (5)sgRNA體外轉(zhuǎn)錄: 以所述PCR擴增產(chǎn)物I為模板，用T7 RNA聚合酶進行sgRNA體外轉(zhuǎn)錄，得到sgRNA ;所述sgRNA經(jīng)無水乙醇法沉淀后使其濃度為1000ng/ul ； (6)Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄: 以U7驅(qū)動的人源化的Cas9編碼序列為模板，用U7 RNA聚合酶進行Cas9體外轉(zhuǎn)錄，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA ;所述Cas9 mRNA經(jīng)無水乙醇法沉淀后使其濃度為600ng/ul ； (7)斑馬魚受精卵的顯微注射及突變檢測: 將所述sgRNA與所述Cas9 mRNA等量混合后，顯微注入到1~2細胞期的野生型斑馬魚受精卵，待胚胎發(fā)育至24 hpf時，取5枚胚胎，制備基因組DNA模板，然后以所述突變檢測引物F-eda和所述突變檢測引物R-eda進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物II ;將所述PCR擴增產(chǎn)物II亞克隆到pEASY-T3載體中；并以T7和Sp6通用引物對轉(zhuǎn)化子進行擴增，將PCR產(chǎn)物十個一組共兩組直接送測序，測序引物為T7或Sp6其中一條； (8)突變體鱗片發(fā)育觀察及染色鑒定: 對檢測有EDA基因突變的斑馬魚的鱗片發(fā)育情況進行顯微觀察，篩選獲得EDA基因外顯子4靶位點引入插入突變導(dǎo)致鱗片缺失突變體，對鱗片發(fā)育異常個體進行鱗片染色鑒定，以確定鱗片是否有發(fā)育缺陷。3.如權(quán)利要求1所述的一種由Crispr/Cas9誘導(dǎo)的鱗片缺失斑馬魚模式的應(yīng)用，其特征在于:該鱗片缺失斑馬魚模式應(yīng)用于皮膚附件相關(guān)基因功能的驗證及外胚層發(fā)育不良藥物的篩選。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種由Crispr/Cas9誘導(dǎo)的鱗片缺失斑馬魚模式，該模式是指包含EDA基因外顯子4位點堿基插入的鱗片缺失斑馬魚。同時，本發(fā)明還公開了該模式的建立方法和應(yīng)用。本發(fā)明建立的鱗片缺失斑馬魚模式在皮膚附件相關(guān)基因功能研究、篩選治療人類頭發(fā)稀少等外胚層發(fā)育不良藥物等方面具有很大的應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N15/89, A01K67/027, C12N15/11, C12N15/55
【公開號】CN104928321
【申請?zhí)枴緾N201510071972
【發(fā)明人】張存芳, 趙凱, 童超, 劉思嘉, 湯永濤, 馮晨光, 張仁意, 李國剛
【申請人】中國科學(xué)院西北高原生物研究所
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年2月12日