一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子快速制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海洋生物活性多肽的制備方法，尤其涉及一種赤魟軟骨多肽類血 管生成抑制因子快速制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成，采用抗血管療法治療腫瘤具有高 效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。因此，尋找活性顯著地血管生成抑制因子成為抗腫瘤藥 物的研宄熱點(diǎn)。腫瘤血管生成受多種因子影響，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)是最重要的 血管生成因子，也是內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要執(zhí)行者，直接參與新生血管形成過程。 研宄表明VEGF必須通過與位于細(xì)胞膜上的特異性受體VEGFR-2結(jié)合來發(fā)揮作用，因而以 VEGFR-2為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選成為抗腫瘤血管生成的重要策略。
[0003] 制備和篩選方法在抗腫瘤藥物研宄中非常重要，而常規(guī)的方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，所得到的 活性物質(zhì)假陽性率高，而比較理想的制備和篩選方法應(yīng)是將制備方法和篩選方法有效結(jié) 合，最大限度地保證抗腫瘤藥物研發(fā)的成功率。
[0004] 軟骨魚軟骨富含多種抗腫瘤活性物質(zhì)，主要包括血管生成抑制因子、抗腫瘤因子 和抗入侵因子，但目前尚未得到有效利用。雖已有報(bào)道從赤魟、孔鰩等軟骨中制備血管生成 抑制因子，但得到的活性物質(zhì)因?yàn)榉肿恿看?，含量低，而難以進(jìn)行藥物開發(fā)。
[0005] 基于以上現(xiàn)狀，本發(fā)明以赤魟軟骨為材料，采用酶解和細(xì)胞膜色譜技術(shù)建立了腫 瘤血管生成抑制因子的快速制備方法，并提供一種活性顯著的赤魟軟骨多肽類血管生成抑 制因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的快 速制備方法。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種赤魟軟骨多肽類血管生成 抑制因子的快速制備方法，其包括以下步驟： 1) 細(xì)胞膜懸液的制備：取血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子特異性受體（VEGFR)高表達(dá)的、處于對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，采用MEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到IO5~IO7時(shí)，應(yīng)用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，于4°c、1000 r/min離心10~ 15 min，取沉淀用生理鹽水清洗2次后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超聲25~30 min 破碎細(xì)胞，將懸液于1000 r/min、4°C條件下離心5~10 min，取上清液于12000 r/min、4°C 條件下離心20~25 min，得細(xì)胞膜沉淀，用生理鹽水重懸，清洗2~3次后，加入生理鹽水 至膜蛋白含量為2. 0~2. 3 mg/mL，即為細(xì)胞膜懸液； 2) 細(xì)胞膜固定相的制備：取預(yù)處理的大孔球形硅膠加入到低溫（4°C)反應(yīng)管中，在振 蕩條件下，按照固液比Ig :25~30 mL將細(xì)胞膜懸液加入到反應(yīng)管中，吸附15~20 h，超 聲研磨20~25 min后，于4000 r/min離心10~15 min，收集沉淀，用生理鹽水洗絳2~ 3次，除去未結(jié)合的細(xì)胞膜，得細(xì)胞膜固定相； 3) 赤魟軟骨蛋白的制備與酶解：將破碎勻漿的赤魟軟骨按固液比I g:10~15 mL加入 到1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，4 °C、振蕩抽提44~48 h后，于4 °C、10000 r/min離心15~ 20 min，取上清液裝入截留分子量為I kDa的透析袋中，用雙蒸水于4 °C以下透析22~24 h，透析液冷凍干燥，得赤魟軟骨蛋白；將赤魟軟骨蛋白按固液比I g :15~20 mL加入到巴 比妥鈉-鹽酸緩沖液（pH 7. 0)中，按照赤魟軟骨蛋白質(zhì)量的1. 5~2. 5%加入中性蛋白酶 (酶活力彡1.0XlO5 U/g)，酶解溫度55~65 °C，酶解3~4 h，將溶液升溫至90~95°C， 并于此溫度保持10~15 min，溫度降至35~40 °C，用NaOH調(diào)pH至7. 5~8. 0,按照赤 魟軟骨蛋白質(zhì)量的1.5~2. 5%加入胰蛋白酶(酶活力彡1.9X IO4 U/g)，酶解溫度為35~ 40 °C，酶解3~4 h，將溶液升溫至90~95°C，并于此溫度保持10~15 min，于10000 r/ min、4°C條件下離心15~20 min，取上清液，上清液采用I kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集 分子量小于I kDa部分，置于截留分子量為100的透析袋中，三蒸水透析24 h，凍干，得酶解 物活性組分； 4) 赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的制備：將酶解物活性組分用三蒸水配成 0. 03~0. 05 mg/mL的溶液，將細(xì)胞膜固定相按照固液比I g: IOmL加入到活性組分溶液中， 35~40°C保溫孵育2~3 h后，4000 r/min離心10~15 min，留取上清液，沉淀用三蒸 水淋洗8~10次，合并洗滌液和上清液，凍干，即為細(xì)胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立 酶解物活性組分和細(xì)胞膜吸附剩余物的指紋圖譜，純化制備消失或峰面積顯著減小的差異 峰，并對(duì)其進(jìn)行雞胚絨毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用測(cè)定，活性最強(qiáng)峰經(jīng)蛋白/多肽序 列分析儀測(cè)定氨基酸序列為Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)，ESI-MS檢測(cè)分子 量為 865. 98 Da。
[0008] 優(yōu)選，所述1)中的腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞Bel-7402 ; 優(yōu)選，所述2)中大孔球形硅膠的預(yù)處理方法為：將大孔球形硅膠(規(guī)格：5 μm，200A) 中加入適量HCl溶液（I mol/L)，超聲處理15~20 min，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶瓶中攪拌回流水 解2~3 h后，將硅膠移至燒杯中，加雙蒸水洗滌3~5次，每次25~30 min。將洗滌處理 好的大孔球形硅膠減壓抽干，于120 °C下活化6~8 h。
[0009] 優(yōu)選，所述4)中RP-HPLC條件為：進(jìn)樣量為5~10 μ L ;色譜柱為Amethyst C18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);洗脫條件為0~40 min內(nèi)乙腈濃度由10%勾速升至50%;流 速0· 4 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。
[0010] 本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種赤魟軟骨多肽類血 管生成抑制因子的應(yīng)用，其特征在于Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)對(duì)雞胚絨 毛尿囊膜（CAM)血管生成具有顯著抑制作用，Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)具 有安全無毒副作用和活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提取、純化工藝較先進(jìn)、快速、準(zhǔn)確度高，制 得的血管生成抑制因子活性顯著，可用于腫瘤疾病的治療。
[0012]
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明步驟示意圖； 圖2是本發(fā)明的酶解物活性組分（A)和細(xì)胞膜吸附剩余物（B)的RP-HPLC指紋圖譜。 [0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016] 實(shí)施例：一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的制備方法，制備流程如下：赤 魟軟骨一組織破碎一鹽酸胍抽提一超濾一細(xì)胞膜固定相吸附一HPLC指紋圖譜比較分析一 血管生成抑制因子。
[0017] 1)細(xì)胞膜懸液的制備：取血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子特異性受體（VEGFR)高表達(dá)的、處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Bel-7402,采用MEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到IO7時(shí)，應(yīng)用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，于4°C、1000 r/min 離心10 min，取沉淀用生理鹽水清洗2遍后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超聲30 min破 碎細(xì)胞。將懸液于1000 r/min、4°C條件下離心5 min，取上清液于12000 r/min、4°C條件 下離心25 min，得到細(xì)胞膜沉淀，用生理鹽水重懸，清洗3次后，加入生理鹽水至膜蛋白含 量為2. 2 mg/mL，即為細(xì)胞膜懸液； 2)細(xì)胞膜固定相的制備：取預(yù)處理的大孔球形硅膠加入到低溫（4°C)反應(yīng)管中，在振 蕩條件下，按照固液比Ig :25 mL將細(xì)胞膜懸液加入到反應(yīng)管中，吸附15 h，超聲研磨25 min后，于4000 r/min離心15 min，收集沉淀，用生理鹽水洗滌3次，除去未結(jié)合的細(xì)胞膜， 得Bel-7402細(xì)胞膜固定相。
[0018] 3)赤魟軟骨蛋白的制備與酶解：將破碎勻漿的赤魟軟骨按固液比I g : 15 mL加 入到1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，4 °C、振蕩抽提48 h后，于4 °C、10000 r/min離心15 min， 取上清液裝入截留分子量為I kDa的透析袋中，用雙蒸水于4 °C以下透析24 h，透析液冷 凍干燥，得赤魟軟骨蛋白；將赤魟軟骨蛋白按固液比I