反應pH值至7.0。保持反應溫度為14-15°C。反應120min。將反應液與固定化頭 孢丙烯合成酶分離。所得產物用質量分數為30%鹽酸調pH至1. 1-1. 2溶解，過濾，再用質 量分數為20%的氨水溶液調pH值結晶，終點pH5. 0-5. 2。在0-5°C養(yǎng)晶Ih后，洗滌，干燥， 得頭孢丙烯成品。
[0037] 實施例三
[0038] 在反應器中，將3000u的固定化頭孢丙烯合成酶加入至130mL的去離子水中，開啟 攪拌。加入0. 04mol的7-APRA和0. 044mol的D-對羥基苯甘氨酸甲酯。加入氫氧化鈉，調 反應pH值至7. 1。保持反應溫度為10-11°C。反應120min。將反應液與固定化頭孢丙烯合 成酶分離。所得產物用質量分數為30%鹽酸調pH至1. 1-1. 2溶解，過濾，再用質量分數為 20%的氨水溶液調pH值結晶，終點pH5. 0-5. 2。在0-5°C養(yǎng)晶Ih后，洗滌，干燥，得頭孢丙 稀成品。
[0039] 實施例四
[0040] 在反應器中，將3300u的固定化頭孢丙烯合成酶加入至130mL的去離子水中，開啟 攪拌。加入0. 04mol的7-APRA和0. 045mol的D-對羥基苯甘氨酸乙酯。加入氫氧化鈉，調 反應口11值至6.8。保持反應溫度為19-20°0。反應10〇1^11。將反應液與固定化頭孢丙烯合 成酶分離。所得產物用質量分數為30%鹽酸調pH至1. 1-1. 2溶解，過濾，再用質量分數為 20%的氨水溶液調pH值結晶，終點pH5. 0-5. 2。在0-5°C養(yǎng)晶Ih后，洗滌，干燥，得頭孢丙 稀成品。
[0041] 實施例五
[0042] 在反應器中，將3600u的固定化頭孢丙烯合成酶加入至130mL的去離子水中，開啟 攪拌。加入0. 04mol的7-APRA和0. 046mol的D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽。加入氫氧 化鈉，調反應pH值至7. 3。保持反應溫度為16-17°C。反應105min。將反應液與固定化頭 孢丙烯合成酶分離。所得產物用質量分數為30%鹽酸調pH至1. 1-1. 2溶解，過濾，再用質 量分數為20%的氨水溶液調pH值結晶，終點pH5. 0-5. 2。在0-5°C養(yǎng)晶Ih后，洗滌，干燥， 得頭孢丙烯成品。
[0043] 實驗例
[0044] 1，固定化酶的催化性能考察
[0045] 固定化酶與對照品（目前市場用量最大的PGA酶）催化性能的對比：
[0046] (1)對照品固定化酶：
[0047] 對照品PGA酶進行了多批次催化合成頭孢丙烯的性能，7-APRA轉化率隨批次的 變化關系如下圖1所示。對照品PGA酶代表衰減性能的最佳反應時間隨批次的變化如圖 2所示。從圖1可知，對照品PGA酶7-APRA轉化率隨批次的變化總體平穩(wěn)，平均轉化率為 96. 36%。從圖2看出，達到最大轉化率時的最佳反應時間需逐步延長，表明衰減較快。 [0048] (2)固定化頭孢丙烯合成酶：
[0049] 固定化酶催化合成頭孢丙烯時，7-APRA轉化率隨批次的變化關系如下圖1所示。 固定化酶代表衰減性能的最佳反應時間隨批次的變化如圖2所示。由圖1可知，固定化酶 催化時7-APRA轉化率比較穩(wěn)定，平均轉化率為99. 03%。由圖2可知，發(fā)白時間延長較慢， 更穩(wěn)定。
[0050] 從上述對比看出，固定化酶催化反應時，7-APRA轉化率高于對照品，反應批次多， 衰減慢，更為穩(wěn)定。
[0051] 2,對實施例一~五所得的頭孢丙烯產品進行性能測試
[0052] 純度、單雜、總雜主要用HPLC檢測。
[0053] 檢測結果如下表所示：
[0054]
[0055] 從以上結果可知：本發(fā)明工藝簡單，操作方便，反應時間短、能耗低、污染少。所得 產品質量好，收率高。因此，本發(fā)明是一種高效率的綠色生產工藝。
【主權項】
1. 一種酶法合成頭孢丙稀的工藝，其特征在于，具體步驟如下： (1) 采用氨基環(huán)氧型載體固定化得到固定化頭孢丙烯合成酶； (2) 將步驟（1)所得的固定化頭孢丙烯合成酶、7-氨基-3-丙烯基-頭孢烷酸、D-對 羥基苯甘氨酸衍生物加入至水中攪拌混合，得混合液； 所述的7-APRA與D-對羥基苯甘氨酸衍生物的摩爾比為1/1. 05~1. 20,固定化頭孢丙 稀合成酶在反應體系中的濃度為10~40u/mL; (3) 用3mol/L的鹽酸溶液和lmol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)步驟2)所得的混合液pH值 為6. 5-7. 5,控制混合液溫度為5-25°C，反應60-180min，直至7-APRA殘留濃度為O-Img/ mL，結束反應； (4) 取步驟3)所得的混合液，通過篩網，分離出反應液和固定化酶； (5) 反應液用質量分數為30 %的鹽酸溶液溶清至pH為一定值，再用質量分數為20 %的 氨水溶液結晶至PH為一定值，養(yǎng)晶，洗滌，干燥，即得產品頭孢丙烯。2. 如權利要求1所述的酶法合成頭孢丙烯的工藝，其特征在于，步驟（1)中所述的氨基 環(huán)氧型載體是苯乙烯系大孔吸附樹脂、丙烯酸系大孔吸附樹脂中的一種或兩種組合。3. 如權利要求1所述的酶法合成頭孢丙烯的工藝，其特征在于，步驟（2)中所述的 D-對羥基苯甘氨酸衍生物選自D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸乙酯、D-對羥 基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽、D-對羥基苯甘氨酸乙酯鹽酸鹽中的一種或多種組合。4. 如權利要求1所述的酶法合成頭孢丙烯的工藝，其特征在于，步驟（3)中所述的 7-APRA殘留濃度為 0-0. 5mg/mL。5. 如權利要求1所述的酶法合成頭孢丙烯的工藝，其特征在于，步驟（4)中所述的篩網 為 80-120 目。6. 如權利要求1所述的酶法合成頭孢丙烯的工藝，其特征在于，步驟（5)中所述的用酸 溶清pH值為1. 0-1. 2,堿結晶pH為5. 0-5. 5。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物的合成方法，具體來說是一種固定化頭孢丙烯合成酶的篩選及一種酶法合成頭孢丙烯的工藝方法。針對現有酶法合成頭孢丙烯工藝中，固定化酶的篩選及評價困難，生產工藝步驟繁瑣、控制點差、反應時間長，轉化率低等問題，本發(fā)明提供了一種固定化頭孢丙烯合成酶，及合成頭孢丙烯的新工藝。
【IPC分類】C12N11/08, C12P35/04
【公開號】CN104928340
【申請?zhí)枴緾N201510309589
【發(fā)明人】林炳旺, 喬浩, 趙康, 王玲, 李建國, 方軍, 商愛國
【申請人】山東魯抗立科藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月8日