檢測braf基因突變的方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測基因突變的方法及其試劑盒，特別是涉及一種檢測BRAF基 因突變的方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年增高，晚期及術(shù)后復(fù)發(fā)患者需要生物靶向治療。美國FDA 及我國結(jié)直腸癌術(shù)后治療方案中明確指出，在進(jìn)行一線和二線化療方案實(shí)施中，擬加入靶 向EGFR受體抗體靶向藥物(西妥昔單抗和帕尼單抗）時(shí)，需進(jìn)行藥敏基因突變檢測。國 際大樣本多中心研究表明，同時(shí)進(jìn)行KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因突變檢測，并按此順 序串聯(lián)診斷，可最大限度地準(zhǔn)確預(yù)測患者對于抗體靶向藥物的敏感性(參見文獻(xiàn)Roock WDjClaes BjBernasconi D et al. Effects of KRAS, BRAFj NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol，2010, 11:753-62.)。
[0003] 目前針對BRAF基因突變的檢測方法主要有：直接測序法（Direct Sequencing)、 高分辨率溶解曲線分析技術(shù)（high resolution melting analysis，HRM)和擴(kuò)增阻滯突 變系統(tǒng)技術(shù)（amplification refractory mutation system，ARMS)。直接測序法（Direct Sequencing)以PCR擴(kuò)增技術(shù)為核心，其靈敏度較低大于10%，有礙其臨床廣泛應(yīng)用（參 考文獻(xiàn) Lynch Tj Bell D，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non - small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med，2004, 350 (21) :2129-2139. Paez J，Janne P，Lee J，et al. EGFR mutations in lung cancer:Correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science，2004, 304 (4) : 1497-1500.)。高分辨率溶解曲線分析技術(shù) (high resolution melting analysis，HRM)是利用不同長度或不同堿基組成的DNA序列 溶解曲線不同的原理，在PCR擴(kuò)增后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔點(diǎn)不同完成對樣品突變分析，其靈 敏度可達(dá)1%，但需要高靈敏度的精密Q-PCR儀，多用于研究中，限制了其臨床應(yīng)用（參考文 獻(xiàn) Li LHj Tze KEj Chih CCj et al. Characteristics and prevalence of KRAS, BRAFj and PIK3CA mutations in colorectal ancer by high-resolution melting analysis in Taiwanese population. Clinica Chimica Acta，413 (2012) 1605 - 1611) ?擴(kuò)增阻滯突變 系統(tǒng)技術(shù)（amplification refractory mutation system，ARMS)是設(shè)計(jì)引物 3'端序列 分別野生和突變互補(bǔ)，針對突變的等位基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增和鑒定。另外Scorpions為 蝎形結(jié)構(gòu)的特異性探針，包含一個(gè)與Y端共價(jià)相連的PCR引物，引物僅僅識別突變序 列，而不識別正常序列，在即時(shí)PCR反應(yīng)中，當(dāng)探針與擴(kuò)增子（即突變序列）連接進(jìn)行擴(kuò)增 時(shí)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，反應(yīng)試劑中熒光度增強(qiáng)。Scorpions與ARMS技術(shù)聯(lián)和應(yīng) 用（SARMS)可檢測單個(gè)突變，對于已知基因的檢測，SARMS具有高度的敏感性0.1%。該方 法的缺點(diǎn)是：1)每種特異性引物或探針只能針對某一種基因突變類型進(jìn)行鑒定；2)可能 出現(xiàn)由于單一堿基錯(cuò)配造成的假陽性。該方法主要用于各類組織，包括手術(shù)、穿刺或鏡 檢組織類，2小時(shí)即可完成檢測，試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認(rèn)可程度高，國內(nèi)已有試劑盒 獲 SFDA 生產(chǎn)批文【參考文獻(xiàn) Newton CR，Graham A，Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA: the amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acids Res, 1989, 17(7):2503-2516. Marcin M. Machnicki, Eliza GM1Tomasz L, et al. ARMS-PCR for detection of BRAF V600E hotspot mutation in comparison with Real-Time PCR-based techniques. ACTA BIOCHIMICA POLONICA, VoI. 60, Nol/2013:57 - 64.Fox JC, et al. The detection of K~ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system, Br J Cancerl998;77:1267-74. ]〇
[0004] 肽核酸是一種DNA類似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯 糖，其較之傳統(tǒng)DNA探針具有不少優(yōu)點(diǎn)：1) PNA十分穩(wěn)定，正確配對的DNA/PNA的穩(wěn)定性 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相應(yīng)的DNA/DNA，同時(shí)在PCR反應(yīng)過程中PNA不可作為Taq酶的底物，亦不會(huì)被 其他酶所降解。2)對于錯(cuò)配的PNA/DNA，哪怕只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，也會(huì)造成其融解溫度 下降9 一 KTC左右。目前，肽核酸作為一種非常有用分子生物學(xué)工具已在疾病的診斷、 治療等領(lǐng)域得到應(yīng)用（參見文獻(xiàn)：張兵波等，PNA探針與DNA探針的系統(tǒng)比較A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通報(bào)》2006 ;9 :62-68 ;Egholm M， et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature, 1993, 365:566 ~568.)。韓國 PANAGENE 公司和美國 PNA Bio Inc.公司均應(yīng)用PNA作為鉗制探針，阻遏野生DNA序列的擴(kuò)增，使突變序列得以擴(kuò)增檢 測，用于突變序列的篩查，研制了 BRAF突變檢測試劑盒，但這些檢測方法不能準(zhǔn)確檢出突 變類型，且受到不同突變類型之間的交叉干擾。
[0005] 針對BRAFV600位點(diǎn)，Cosmic網(wǎng)站發(fā)布突變類型和頻率如下表1所示。
[0006] 表1Cosmic網(wǎng)站發(fā)布的BRAFV600突變類型及頻率
[0007]
[0008] 目前國際臨床研究進(jìn)行BRAF突變檢測多集中于高頻出現(xiàn)的V600E和V600K，其具 有腫瘤診斷和指導(dǎo)靶向用藥的臨床意義，且已大量臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，而對于其他突變類型(如 V600D，V600_K601>E，V600M和V600R)的臨床意義目前無準(zhǔn)確報(bào)道。
[0009] 綜上所述，BRAF高頻出現(xiàn)的V600E和V600K突變具有臨床診斷意義，但目前報(bào)道 的高靈敏度的PCR檢測方法，缺乏一定特異性、靈敏性及準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度和高特異度的檢測BRAF基因第15 號外顯子（exonl5)突變（V600E和V600K)的方法及其試劑盒。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一方面，提供一對用于檢測BRAF基因第15號外 顯子突變V600E和V600K的引物對，包括：
[0012] 1)如SEQ ID NO. 1所示的上游序列和如SEQ ID NO. 2所示的下游序列；或者
[0013] 2)至少與SEQ ID NO. 1所示的上游序列80%相同的序列和至少與SEQ ID NO. 2所 示的下游序列80%相同的序列。
[0014] 本發(fā)明的第二方面，提供一種用于檢測野生型BRAF基因的探針，包括：包含SEQ ID NO. 3所示序列的探針（Probel野生)。
[0015] 其中，所述探針（Probel野生）的兩端還分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(包括：FAM、 ViC、NED、Cy3、Cy5、J0E、TEXASRED 或 TAMRA 等）和熒光淬滅基團(tuán)（包括：MGB (minor groove binder)或TAMRA)。如該探針可為一種Taqman-MGB探針。
[0016] 本發(fā)明的第三方面，提供一種用于檢測BRAF基因第15號外顯子突變V600E的探 針，包括：包含SEQID NO. 4所示序列的探針（Probe2突變El )、包含SEQ ID NO. 5所示序列 的探針（Probe3突變E2)或包含SEQ ID NO. 6所示序列的探針（Probe2突變E1E2)。
[0017] 其中，所述用于檢測BRAF基因第15號外顯子突變V600E的探針的兩端還可分別 標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(包括：FAM、ViC、NED、Cy3、Cy5、JOE、TEXASRED或TAMRA等）和熒光淬 滅基團(tuán)（包括：MGB (minor groove binder)或TAMRA)。如該探針可為一種Taqman-MGB探 針。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供一種用于檢測BRAF基因第15號外顯子突變V600E的PNA (聯(lián)合肽核酸）阻遏序列，包括：SEQ ID NO. 7所示的PNA阻遏序列（PNA-NBN-W)或SEQ ID NO. 8所示的PNA阻遏序列（PNA-HNN-K);
[0019] SEQ ID NO. 7 ：TTGGTCTAGCTACANBNAAATC ;其中，M 表示 A、C、G 或 T，S 表示 C、G 或 τ，如選自以下組合：
[0020] ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、ATA、ATT、ATC、ATG、TCA、TCT、TCC、TCG、 TGA、TGT、TGC、TGG、TTA、TTT、TTC、TTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC、GGG、GTA、GTT、 GTC、GTG*、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、CTA、CTT、CTC 或者 CTG ;主要封閉 了野生 型 V600 (GTG)、突變 V600M (ATG)和突變 V600R (AGG)。
[0021] 其中，AGG、ATG、GTG*為已報(bào)道存在的野生或突變序列，參照上述Cosmic網(wǎng)站發(fā)布 突變類型，加*為獨(dú)特封閉的序列。
[0022] SEQ ID NO. 8 ：TTGGTCTAGCTACAHNNAAATC ;其中，H 表示 A、C 或 T，M 表示 A、C、G 或 T，如 H塑選自以下組合：AAA、AAT、AAC、AAG*、ATA、ATT、ATC、ATG、AGA、AGT、AGC、AGG、ACA、 ACT、ACC、ACG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTT、CTC、CTG、CGA、CGT、CGC、CGG、CCA、CCT、CCC、 CCG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TTG、TGA、TGT、TGC、TGG、TCA、TCT、TCC 或者 TCG ;主 要封閉了突變 V600K (AAG)、突變 V600M (ATG)和突變 V600R (AGG)。
[0023] 其中，AAG*、ATG、AGG為已報(bào)道