一種檢測與早產(chǎn)相關(guān)β2腎上腺素受體基因單核苷酸多態(tài)性位點的特異性引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測與早產(chǎn)相關(guān)β 2腎上腺素受體基因（Aeia-J-ai/reflergic rec6>/7ior，^B^?)單核苷酸多態(tài)性位點rsl042713的特異性引物，屬分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 早產(chǎn)是圍生兒死亡的重要原因之一，發(fā)生率為5%~15%，我國的早產(chǎn)發(fā)生率為 7. 8%。全球大約有1300百萬女性早產(chǎn)，早產(chǎn)使新生兒的死亡率和發(fā)病率大幅度升高，并且 對健康有長期的不良影響。早產(chǎn)的嬰兒比足月生產(chǎn)的嬰兒易患腦癱，感覺障礙，學(xué)習(xí)失能 和呼吸系統(tǒng)疾病，通過大量的流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，成年后早產(chǎn)仍為心血管病、糖尿病等代謝疾 患的重要因素。根據(jù)世界衛(wèi)生組織評估結(jié)果顯示，世界每年有一億三千萬新生兒出生，有 八百萬在出生一整年之前死亡。早產(chǎn)仍然是由多種因素引起的一個主要公共健康問題。
[0003] 遺傳易感性是早產(chǎn)發(fā)生過程中不可忽視的一個危險因素，因為早產(chǎn)已被證明表現(xiàn) 出家族性和復(fù)發(fā)性的特點。對早產(chǎn)的遺傳學(xué)研宄多是應(yīng)用基于單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP)標記的關(guān)聯(lián)分析，以研宄早產(chǎn)的遺傳易感性。基因多態(tài)現(xiàn) 象可能造成了機體對一定刺激作用下所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有所不同，使一些相關(guān)細胞因子和 基因等表達增強或減弱，最終通過炎癥反應(yīng)、凋亡、細胞外基質(zhì)降解等一個或幾個環(huán)節(jié)導(dǎo)致 早產(chǎn)的發(fā)生。
[0004] 近年來，很多學(xué)者證明β2腎上腺素受體基因 （Aeia -iSaiZreflergic rece/7 i or, 也祝似)與早產(chǎn)相關(guān)，因為該基因可以通過抑制子宮收縮來防止早產(chǎn)的發(fā)生。在已知的也祝似 多態(tài)性中，我們選取了編碼區(qū)中的rsl042713多態(tài)性位點（Argl6Gly; R16G; rsl042713; A -G)。在rsl042713 (R16G)多態(tài)性位點中的精氨酸（A等位基因）是有促進激動劑降低 敏感度的作用，并且純合子（AA基因型）已經(jīng)有研宄報道與防止早產(chǎn)相關(guān)。
[0005] 目前，檢測SNP的方法有很多，包括變性高效液相色譜分析技術(shù)（Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、高分辨溶解曲線分析法（High resolution melting，HRM)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism, SSCP)、內(nèi)切酶酶切技術(shù)（Endonuclease digestion)、等位基因特異性雜交（Allele specific hybridization，ASH)，SNaPshot 技術(shù)，等位基因特異性 PCR (AS-PCR)等方法，但 由于dHPLC、HRM和SNaPshot技術(shù)需要昂貴的實驗設(shè)備，很難在實驗室普及。SSCP技術(shù)不 能確定突變類型和具體位置，ASH技術(shù)操作繁瑣且可重復(fù)性差，人類基因組中只有不到1/3 的多態(tài)性影響限制性內(nèi)切酶的識別序列，使其應(yīng)用受到一定的限制。等位基因特異性PCR 方法以簡便，快速，成本低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于SNP的檢測。等位基因特異性PCR特異引物 在一種基因型中有擴增產(chǎn)物，在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物，用凝膠電泳和酶標儀就能 夠很容易地分辨出擴增產(chǎn)物的有無，從而確定是否含有多態(tài)性位點SNP。酶標儀以其高靈敏 度，可靠性強，易于操作，自動化程度高等優(yōu)點，更適于批量檢測樣本SNP位點。
[0006] 經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的利用等位基因特異PCR方法檢測突變位點 rsl042713的公開報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的為提供一種檢測與早產(chǎn)相關(guān)基因 β 2腎上腺素受體U/祝似)基因的 單核苷酸多態(tài)性位點rsl042713的特異性引物。
[0008] 本發(fā)明一種用于檢測與早產(chǎn)相關(guān)β 2腎上腺素受體基因 （Ae recepior，也祝似）單核苷酸多態(tài)性rsl042713的特異性引物，其特征在于該引物序列見下 表，其中ADRB2-a和ADRB2-g為檢測多態(tài)性rsl042713的特異性引物，ADRB2-F和ADRB2-R 為驗證引物。
[0009] 本發(fā)明中，等位基因特異性引物PCR技術(shù)是一種簡便、特異性較高、費用少的、便 于推廣的SNP檢測方法，特別適合于大樣本群體基因單核苷酸多態(tài)性研宄，值得在基因 SNP 研宄中進一步推廣。
【附圖說明】
[0010] 圖1為測序驗證rsl042713位置為G/A多態(tài)性的峰圖。
[0011] 圖2為測序驗證rsl042713位置為A的峰圖。
[0012] 圖3為測序驗證rsl042713位置為G的峰圖。
[0013] 圖4為特異性引物梯度PCR產(chǎn)物的電泳圖譜。
[0014] 圖5為用本發(fā)明進行等位基因特異PCR檢測rsl042713的電泳圖譜。
[0015] 圖6為酶標儀檢測AS-PCR產(chǎn)物陰性結(jié)果和陽性結(jié)果的OD值對比圖。 具體實施方案
[0016] 本發(fā)明利用等位基因特異性PCR的方法檢測β 2腎上腺素受體U/祝似)基因的單 核苷酸多態(tài)性位點rsl042713,具體步驟如下： (1) 收集臨床血液樣本，對臨床血液樣本進行基因組DNA提取 (2) 設(shè)計驗證引物及位點特異性引物 (3) 以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以包含rsl042713位點的驗證引物進行PCR 反應(yīng)，將得到的PCR產(chǎn)物純化后，進行直接測序分析，驗證存在rsl042713位點多態(tài)性。
[0017] (4)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以本發(fā)明設(shè)計的檢測多態(tài)性位點 rsl042713的特異性引物退火溫度進行摸索后，進行PCR擴增。
[0018] (5)利用瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物檢測，根據(jù)有無電泳條帶并且通過比較分 析酶標儀檢測AS-PCR產(chǎn)物的OD值，判斷是否含有rsl042713多態(tài)性位點。
[0019] (6)與測序結(jié)果比對，驗證AS-PCR方法檢測rsl042713的準確性。
[0020] 表1 AS-PCR所用引物組成、序列及產(chǎn)物大小
本發(fā)明基于AS-PCR的原理，設(shè)計兩條3'末端分別與SNP兩個等位基因堿基配對的上 游引物（Seq IDl:ADRB2-a，Seq ID2:ADRB2_g)，同時在兩個等位基因特異性引物:V端第 4位堿基引入錯配（堿基A突變成堿基T)以增加引物特異性，下游為公用引物（Seq ID4: ADRB2-R)。為檢測等位基因特異性PCR方法的可靠性，在遠離rsl042713位點設(shè)計一條上 游引物（Seq ID3 !ADRB2-F)，利用共同的下游引物ADRB2-R進行PCR后測序驗證。無論檢 測的標本是否含有rsl042713多態(tài)性位點，引物ADRB2-F/ ADRB2-R都會擴增出PCR產(chǎn)物。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，根據(jù)有無電泳條帶或者酶標儀檢測PCR產(chǎn)物的OD光度值 就可以確定樣本中是否含有SNP位點。
[0021] 實施例1:米集臨床血液樣本并進彳丁基因組DNA提取 (1)收集臨床早產(chǎn)孕婦和足月產(chǎn)孕婦外周血各20例，所有人員均詳細記錄臨床基本 資料和檢測資料，在簽署知情同意書后，每人采集血液樣本3-5 ml。
[0022] (2)樣品基因組DNA提取 使用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血樣本中基因組DNA。
[0023] 操作步驟： (1)處理血液材料 取200 μ 1的血液樣品于I. 5ml離心管中。
[0024] (2)加入 20 μ I Proteinase K 溶液，混勾。
[0025] (3)加200 μ 1緩沖液GB，充分顛倒混勾，56°C放置10 min，其間顛倒混勻數(shù)次， 溶液應(yīng)變清亮。
[0026] (4)加200 μ 1無水乙醇，充分顛倒混勾，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
[0027] (5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收 集管中)，12,000 rpm(~13,400Xg )離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入 收集管中。
[0028] (6)向吸附柱 CB3 中加入 500 μ 1 緩沖液⑶，12, 000 rpm(~13, 400Xg )離心 30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0029] (7)向吸附柱 CB3 中加入 600 μL 漂洗液PW，1