用于mtrr基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測的引物組、其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸的測定與檢驗(yàn)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于MTRR基因位點(diǎn)多態(tài) 性檢測的引物組、其檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國是世界上出生缺陷的高發(fā)國家之一，每年的出生缺陷兒數(shù)量約占全世界的 20%。葉酸缺乏是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要原因。導(dǎo)致機(jī)體缺乏葉酸有兩個(gè)方面的原因： 一是葉酸攝入量不足，二是由于遺傳(基因）缺陷導(dǎo)致機(jī)體對葉酸的利用能力低下（葉酸代 謝通路障礙)。5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR)等基 因變異引起的相應(yīng)的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，導(dǎo)致低葉酸血癥和 高同型半胱氨酸血癥，從而增加新生兒出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)或自發(fā)性流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 同型半胱氨酸（Hcy)，是人體內(nèi)一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。在 Hcy代謝過程中，葉酸和亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)起關(guān)鍵作用，葉酸和MTHFR共同為 Hcy代謝提供甲基供體。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)作為同型半胱氨酸（Hcy)代謝途 徑中的關(guān)鍵酶之一，同樣甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR)也是同型半胱氨酸（Hcy)代謝途徑 中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其MTRA2756G位點(diǎn)多態(tài)性可能導(dǎo)致血中Hcy水平的改變。甲硫氨酸合成 酶還原酶是保持MTR活性的關(guān)鍵酶，其基因 G66A位點(diǎn)多態(tài)性亦可通過影響MTRR的活性而 影響血中Hcy的水平。因此，檢測MTRR基因的多態(tài)性能夠用于臨床指導(dǎo)5-FU類、甲氨蝶呤 等個(gè)體化用藥及育齡期婦女葉酸補(bǔ)充，具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了用于MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測的引物組，本發(fā)明還提供了 MTRR基 因的位點(diǎn)多態(tài)性檢測方法，能夠用于臨床指導(dǎo)5-FU類、甲氨蝶呤等個(gè)體化用藥及育齡期婦 女葉酸補(bǔ)充，具有重大意義。
[0005] 本發(fā)明提供的用于MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測的引物組由PCR擴(kuò)增引物和 SNaPshot擴(kuò)增引物組成，所述PCR擴(kuò)增引物為： MTRR-A66G-Fwd ：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO. I), MTRR-A66G-Rev ：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO. 2)； 所述SNaPshot擴(kuò)增引物為： SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA (SEQ ID NO. 3) 〇
[0006] 本發(fā)明還提供MTRR基因的位點(diǎn)多態(tài)性檢測方法，步驟如下： (1) 采用PCR擴(kuò)增MTRR基因檢測位點(diǎn)所在基因片段并純化； (2) 采用SNaPshot法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微測序，分析測序結(jié)果； 其中，步驟（1)所述擴(kuò)增時(shí)的引物序列為： MTRR-A66G-Fwd ：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO. I), MTRR-A66G-Rev ：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO. 2)； 步驟（2)所述SNaPshot法中使用的引物序列為： SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA (SEQ ID NO. 3) 〇
[0007] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Q5?熱啟動超保真2ΧMaster Mix 12.5yL;H20 5.5 yL;引物 5.0yL，模板 DNA2.0yL;反應(yīng)條件為：98°C 3min;98°C 10s; 58°C 30s;72°C lmin;29 個(gè)循環(huán)；72°C 5min; 25°C 保溫；其中，所述引物為 MTRR-A66G。
[0008] 優(yōu)選地，步驟（2 )中所述SNaPshot法微測序中，SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 為：SNaPshot 預(yù)反應(yīng)混合液 1.25 yL;5 X sequencing buffer 1.50 yL;ddH20 4.25 yL; 2.0以1^似？811〇丨引物；1.(^1^純化產(chǎn)物；反應(yīng)條件為：96°0，1〇8 ;55°0,58;60°0,3〇8;25個(gè) 循環(huán)；4°C保溫；其中，所述SNaPshot引物為SNE-MTRR A66G。
[0009] 本發(fā)明采用上述引物和擴(kuò)增條件高效的MTRR-A66G的核苷酸片段。其中，核苷酸 序列中加黑加大的字母為SNP位點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述引物組在制備檢測用于MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性試 劑中的引用。
[0011] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述引物組在檢測MTRR基因 A66G的多態(tài)性中的應(yīng) 用。
[0012] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述引物組在分析甲氨蝶呤的毒副作用，分析5-FU 的療效，早期發(fā)現(xiàn)高Hcy血癥，分析葉酸缺乏原因中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的MTRR基因的多態(tài)性檢測方法具有高靈敏性、高準(zhǔn)確度和高精密性的優(yōu) 點(diǎn)，是一種便捷可靠的MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測。應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法能夠有效指導(dǎo)臨 床5-FU類個(gè)性化用藥，能夠做到早期發(fā)現(xiàn)、早期糾正高Hcy血癥；同時(shí)，為育齡期婦女補(bǔ)充 葉酸提供基因依據(jù)。
【附圖說明】
[0014] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本發(fā)明SNaPshot法檢測MTRR A66G基因多態(tài)性的檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0016] 本申請所用儀器參見表1。
[0017] 表1本申請實(shí)驗(yàn)所用儀器 本申請所用試劑如下：
Q5TM熱啟動超保真2XMasterMix，購自NEB公司，貨號：M0494L，-20°C。
[0018] 實(shí)施例1 一.采用PCR法擴(kuò)增檢測位點(diǎn)所在基因片段 1待測樣本DNA提取 本檢測采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取外周血DNA，提取步驟參考試劑盒說明 書。
[0019] 試劑準(zhǔn)備 a、 本申請中引物序列為本申請人自行設(shè)計(jì)，具體序列參見表2，Invitrogen公司生產(chǎn)， 使用濃度為5. Opmol/μ L ;干粉于-20°C保存，有效期一年；工作液于4°C保存，有效期半年； 基因參考序列號為
SNP位點(diǎn)參考NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫。
[0020] 表2 PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物序列
b、 取出Q5?熱啟動超保真2 XMaster Mix，primers，ddH20,室溫融化后，短暫離心；配 制引物為MTRR A66G，震蕩混勻；短暫離心后備用； 反應(yīng)體系配制： Q5? 熱啟動超保真 2 X Master Mix 12. 5 yL H2O 5. 5 μ L 共計(jì) 18 μ Ld
[0021] 震蕩混勻，短暫離心后，分裝18. 0 μ L至標(biāo)記好的PCR反應(yīng)管；在PCR反應(yīng)管中加 入引物5. 0 μ L后轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū)。本檢測使用高保真熱啟動聚合酶，因此，在工作過程 中可預(yù)先配制好18. 0 μ L的反應(yīng)體系并保存于-20°c，每次使用時(shí)取出，加入5. 0 μ L引物即 可用于檢測，也可將引物直接與聚合酶混合，保存于-20°C備用。
[0022] 加樣擴(kuò)增 向分裝好的PCR反應(yīng)管中加入2. OyL稀釋后的模板；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下： 98°C 3min ;98°C IOs ;58°C 30s ;72°C Imin ;29 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ; 25°C