一種檢測(cè)雙歧桿菌的lamp檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雙歧桿菌的LAMP檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法，尤其涉及食品中 的雙歧桿菌的LAMP檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙歧桿菌屬細(xì)菌（Bifidobacterium spp.)是一類革蘭氏陽性桿菌，因其可以 產(chǎn)生雙歧因子，維護(hù)腸道正常菌群和調(diào)節(jié)腸道等功能，故被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域， 是一類腸道益生菌。常用于益生菌制品（食品和藥品）的雙歧桿菌菌種有青春雙岐桿 菌（B.adolescentis)、嬰兒雙岐桿菌（B.infantis)、長(zhǎng)雙岐桿菌（B.longum)、短雙岐桿菌 (B.breve)和兩歧雙岐桿菌（B.bifidum)等。
[0003] 雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，對(duì)生長(zhǎng)和培養(yǎng)的環(huán)境要求高，檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，試驗(yàn)過程容易 受到多種因素的干擾，導(dǎo)致對(duì)其定性和定量的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差。近年來分子生物學(xué)技 術(shù)迅猛發(fā)展，針對(duì)雙歧桿菌特異性核酸片段的檢測(cè)方法也逐漸成熟。Matsuki T.等采用 焚光定量 PCR 檢測(cè)方法（Matsuki T，Watanabe K，F(xiàn)ujimoto J et al. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal Bifidobacteria. Appl Environ Microbiol[J]2004,70(I):167-173)以 16S rDNA序列為目標(biāo)位點(diǎn)對(duì)人類腸道內(nèi)的雙歧桿菌進(jìn)行快速篩查。在益生菌類食品產(chǎn)品中熒光 定量PCR技術(shù)也有類似應(yīng)用（《檢測(cè)食品中乳酸菌的方法及檢測(cè)用引物》，CN 103667509A， 2014年3月26日）。該類方法采用或不采用熒光染料（或熒光探針），利用一對(duì)擴(kuò)增引物 檢測(cè)樣品中的目標(biāo)核酸序列。但該類方法所用核酸擴(kuò)增步驟需要頻繁的進(jìn)行升溫和降溫過 程，耗時(shí)至少需要Ih以上，并需要使用到大型輔助設(shè)備，如電泳儀、DNA擴(kuò)增儀或測(cè)序儀等 輔助進(jìn)行結(jié)果判斷，無法適應(yīng)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)條件或現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是 Notomi T.于2000年開發(fā)等溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)和多對(duì)特異性引物，特異地識(shí)別革E序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在等溫條件下 完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。近年來，該技術(shù)已逐步應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)，如《一種檢測(cè)甲型副 傷寒沙門氏菌的LAMP試劑盒》CN 102643901 A，2012年8月22日，但目前尚未見該方法用 于食品中雙歧桿菌的檢測(cè)，更無合適高效的引物用于該領(lǐng)域的LAMP檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，提供一種速度快、靈敏度高、特異性檢測(cè)雙 歧桿菌的LAMP檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雙歧桿菌的LAMP檢測(cè)用引物，LAMP檢測(cè)引物為：
[0007] 外引物 F3 :5 ' -GCGTGGACTACCAGGGTAT-3 '
[0008] 外引物 B3 :5 ' -GGGCGTAAAGGGCTCGTA-3 '
[0009] 內(nèi)引物 FIP : 5 ' -AGAACACCAATGGCGAAGGCACACGCTTTCGCTCCTCAG-3 '
[0010] 內(nèi)引物 BIP :5' -CCAGTCTCCCCTACCGCACTCCGGTGTGAAAGTCCATCG-3'
[0011] 環(huán)引物 LF : 5 ' -TCTGGGCCGTTACTGACG-3 '
[0012] 環(huán)引物 LB :5' -GCGCGGATCCACCGTTA-3'
[0013] 本發(fā)明的另一方面是提供一種檢測(cè)雙歧桿菌的LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，使用 上述的LAMP檢測(cè)用引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。
[0014] 為了進(jìn)一步優(yōu)化上述的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的技術(shù)方案還包括：
[0015] 上述的LAMP檢測(cè)方法中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系為：5pM的外引物F3和B3各 1 μ L ;40pM的內(nèi)引物FIP和BIP各1 μ L ;20pM的環(huán)引物L(fēng)F和LB各1 μ L ;2 X反應(yīng)緩沖液 12. 5 μ L ;1 μ L的Bst DNA聚合酶；焚光染料1 μ L ;5 μ L的模板DNA，加滅菌純化水至25 μ L 體系。
[0016] 上述LAMP檢測(cè)反應(yīng)條件為：60°C _65°C恒溫90min。
[0017] 優(yōu)選地，上述LAMP檢測(cè)反應(yīng)條件為：63 °C恒溫90min。
[0018] 上述的LAMP檢測(cè)方法中，檢測(cè)結(jié)果通過測(cè)量濁度值，或以肉眼觀察可見的白色沉 淀，或以肉眼觀察反應(yīng)體系顏色變化來判定檢測(cè)結(jié)果。
[0019] 本發(fā)明另一方面還提供一種雙歧桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，雙歧桿菌LAMP檢測(cè)試劑 盒中包含有上述的LAMP檢測(cè)用引物。
[0020] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過LAMP技術(shù)特有的顏色或濁度變 化檢測(cè)樣品中的雙歧桿菌屬細(xì)菌。本發(fā)明方法不受培養(yǎng)條件的限制，可在60min內(nèi)完成核 酸的檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)雙歧桿菌定性檢測(cè)靈敏度可達(dá)到16. Ipg/μ L(DNA濃度）或0.1 CFU/ mL (細(xì)菌濃度），優(yōu)于一般PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性 好，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可以為監(jiān)管部門對(duì)上市產(chǎn)品的監(jiān)督檢查和突發(fā)事件處理提供快 速的篩查結(jié)果。同時(shí)，本發(fā)明首次設(shè)計(jì)、篩選到雙歧桿菌LAMP檢測(cè)引物，并建立起了雙歧桿 菌LAMP檢測(cè)方法，填補(bǔ)了國內(nèi)外在此檢測(cè)領(lǐng)域的空白。
【附圖說明】
[0021] 圖1為對(duì)5種不同雙歧桿菌屬細(xì)菌采用本發(fā)明的引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)濁度 值與反應(yīng)時(shí)間圖。（a :嬰兒雙歧桿菌；b :長(zhǎng)雙歧桿菌；c :兩歧雙歧桿菌；d :短雙歧桿菌；e : 青春雙歧桿菌）
[0022] 圖2為對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌基因組DNA采用本發(fā)明的引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)IgDNA與 反應(yīng)時(shí)間關(guān)系圖。（模板0嫩濃度分別為&:1.61\10%/^1^山：1.61\10 (^/^1^:I. 61X105fg/yL ；d ：1. 61X104fg/yL)
[0023] 圖3為長(zhǎng)雙歧桿菌菌落計(jì)數(shù)采用本發(fā)明引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)Ig (CFU/mL)與反應(yīng)時(shí) 間關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雙歧桿菌的LAMP檢測(cè)用引物，LAMP檢測(cè)引物為：
[0025] 外引物 F3 :5 ' -GCGTGGACTACCAGGGTAT-3 '
[0026] 外引物 B3 :5 ' -GGGCGTAAAGGGCTCGTA-3 '
[0027] 內(nèi)引物 FIP :5' -AGAACACCAATGGCGAAGGCACACGCTTTCGCTCCTCAG-3'
[0028] 內(nèi)引物 BIP :5' -CCAGTCTCCCCTACCGCACTCCGGTGTGAAAGTCCATCG-3'
[0029] 環(huán)引物 LF : 5 ' -TCTGGGCCGTTACTGACG-3 '
[0030] 環(huán)引物 LB : 5 ' -GCGCGGATCCACCGTTA-3 '
[0031] 同時(shí)本發(fā)明還提供了相應(yīng)地LAMP檢測(cè)方法和試劑盒，下面通過具體實(shí)施例對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范 圍。
[0032] 實(shí)施例1 (實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立）
[0033] 1.引物的制備
[0034] 所用引物序列由Invitrogen公司合成。針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)6條引物，包括兩條內(nèi)引 物（FIP和BIP)和兩條外引物（F3和B3)和兩條環(huán)引物（LF和LB)，其核苷酸序列列于表 1〇
[0035] LAMP擴(kuò)增體系采用日本榮研公司朗報(bào)（Loopamp)脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒。LAMP 檢測(cè)體系的具體配置為5pM的F3和B3各1 μ L ;40pM的FIP、BIP各1 μ L ;20pM的LF和LB 各1 μ L ;2X反應(yīng)緩沖液12. 5 μ L，1 μ L的Bst DN