胎兒宮內(nèi)生長受限診治分子標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種胎兒宮內(nèi)生長受限診治分子標(biāo)志物，具體涉 及PIK3R1基因甲基化及其檢測(cè)試劑在制備胎兒宮內(nèi)生長受限診斷產(chǎn)品以及治療藥物中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胎兒宮內(nèi)生長受限（intrauterine growth restriction，IUGR)，又稱為胎兒宮內(nèi) 發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation, IUGR)，是指出生體重低于相應(yīng)孕周胎兒平 均體重第10百分位數(shù)或低于平均體重兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，是圍產(chǎn)期主要并發(fā)癥之一，其圍生兒病 死率為正常兒的8倍。據(jù)推測(cè)發(fā)展中國家每年約有30million IUGR新生兒出生。IUGR的后 遺癥主要分為生后近期后遺癥和遠(yuǎn)期后遺癥，近期后遺癥主要為IUGR生后血糖代謝紊亂、 溫度調(diào)節(jié)障礙、呼吸窘迫綜合癥、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎和新生兒視網(wǎng)膜病變，是導(dǎo)致新 生兒死亡的主要原因；遠(yuǎn)期后遺癥主要為成年期肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、心 血管疾病和哮喘等。2010年，motrenko等提出〃疾病胚胎起源學(xué)說"，認(rèn)為胚胎形成時(shí)期外 界不良因素可增加成年后慢性疾病的發(fā)生率，其中不良環(huán)境暴露引起的配子、胚胎和胎兒 組織表觀遺傳學(xué)修飾改變，被認(rèn)為是重要的發(fā)病機(jī)理之一。胎兒生長發(fā)育是受多因素調(diào)節(jié) 的復(fù)雜過程，母親懷孕時(shí)營養(yǎng)不良、感染、貧血、低氧狀態(tài)等不良狀況都會(huì)影響胎兒的生長， 使胎兒暴露于一個(gè)非正常調(diào)控的生長環(huán)境中，引起胎兒在物質(zhì)代謝、器官發(fā)育、免疫應(yīng)激等 方面發(fā)生相應(yīng)的改變，且導(dǎo)致相關(guān)基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)上的改變，DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的 修飾途徑之一，也是引起表觀遺傳調(diào)節(jié)反應(yīng)鏈中的啟動(dòng)因素。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié) 構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，異位甲基化引起基因表達(dá) 水平及下游信號(hào)傳遞改變，從而調(diào)控有關(guān)基因的表達(dá)。由此可見，DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄水 平的修飾，在生物發(fā)育調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了重要作用。目前認(rèn)為基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生的甲基化 修飾會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，因此DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)。
[0003] 近年來越來越多的研宄證實(shí)異常DNA甲基化與IUGR顯著相關(guān)。有研宄報(bào)道，IUGR 大鼠胰腺胰十二指腸同源盒Upancreatic duodenum homeobox gene-1，Pdxl)基因啟動(dòng) 子區(qū)甲基化水平顯著升高，Pdxl基因表達(dá)下降，并增加 IUGR患者2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 Einstein等發(fā)現(xiàn)IUGR新生兒⑶34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的胞嘧啶發(fā)生了甲基化的改變。 Yuen等用了 Illumina GoldenGate甲基化芯片研宄發(fā)現(xiàn)在IUGR胎盤組織中有5個(gè)異常的 甲基化區(qū)域。由此可見，多種基因的DNA甲基化修飾參與了 IUGR的發(fā)病過程，因此需要從 全基因組水平上研宄DNA甲基化模式與IUGR發(fā)生的關(guān)系，鑒定出與IUGR相關(guān)的差異甲基 化的基因，并對(duì)其異常甲基化的機(jī)制進(jìn)行深入分析，明確DNA甲基化在IUGR中的調(diào)節(jié)機(jī)制， 采取針對(duì)性措施改善胎兒的生長發(fā)育，對(duì)成年期慢性疾病給予早期防治。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種胎兒宮內(nèi)生長受限診治分子標(biāo)志物，該分子標(biāo)志物為低甲基化 的PIK3R1基因。通過研宄證明，與正常的人群相比，胎兒宮內(nèi)生長受限患者血液中PIK3R1 基因的甲基化水平顯著下調(diào)，根據(jù)兩者的相關(guān)性，通過檢測(cè)體液中PIK3R1基因的甲基化水 平即可判斷受試者是否患有胎兒宮內(nèi)生長受限、或者可以判斷受試者是否存在患有胎兒宮 內(nèi)生長受限的風(fēng)險(xiǎn)，從而實(shí)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限的早期診斷，為疾病的預(yù)防措施的制定和 臨床上個(gè)性化治療方案的制定提供基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)PIK3R1基因甲基化的試劑在制備胎兒宮內(nèi)生長受限診斷產(chǎn) 品中的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷產(chǎn)品包含檢測(cè)PIK3R1基因甲基化的試劑，所述試劑通 過檢測(cè)體液中的PIK3R1基因甲基化水平來判斷受試者是否患有胎兒宮內(nèi)生長受限或者存 在患有胎兒宮內(nèi)生長受限的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 進(jìn)一步，所述體液包括來自出生后新生兒的體液，也包括母體的體液。所述體液包 括身體產(chǎn)生的任何液體，包括但不限于血液、血漿、血清、組織液、腦脊液、唾液、腹腔液、滑 膜液、羊水、尿液、陰道分泌物、胃液、消化液、淋巴液、膽囊液、膽汁。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中可用于檢測(cè)基因甲基化程度或者頻率的方法包括但不限于全基因組 甲基化檢測(cè)技術(shù)，如基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化篩選、基于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲基化 圖譜分析，特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)技術(shù)，如甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸鹽處理后的基因組 測(cè)序法（BSP)、聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA)、甲基化特異性內(nèi)切酶酶切和 定量聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合法（MSRED-qPCR)、熒光定量法（Methylight)、甲基化敏感性高分辨 率熔解曲線分析法（MS-HRM)、焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing)。因此檢測(cè)PIK3R1基因甲 基化的試劑包括利用上述方法檢測(cè)PIK3R1基因甲基化水平時(shí)所需的試劑。
[0008] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，檢測(cè)PIK3R1基因甲基化水平時(shí)所需的試劑包括擴(kuò) 增包含甲基化位點(diǎn)在內(nèi)的PIK3R1基因片段的引物序列，所述引物序列如下所示：
[0009] 5'端引物：
[0010] aggaagagagTGTTTTTTTTAATGTGGTATATTTGTGA ；
[0011] 3'端引物：
[0012] cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAAAATATCACCAAACCACTCCTACo
[0013] 進(jìn)一步，所述診斷產(chǎn)品包含但不限于試劑盒、芯片、測(cè)序平臺(tái)。試劑盒或芯片中包 含可用于檢測(cè)PIK3R1基因甲基化水平的引物或探針。測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷產(chǎn)品，通 過高通量測(cè)序檢測(cè)全基因組信息，在此過程中可以發(fā)現(xiàn)PIK3R1基因甲基化在胎兒宮內(nèi)生 長受限患者和正常人之間存在顯著差異，分析可知利用PIK3R1基因的低甲基化與胎兒宮 內(nèi)生長受限相關(guān)從而出具診斷報(bào)告或者提供治療建議，上述內(nèi)容也包含在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種用于診斷胎兒宮內(nèi)生長受限的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含能夠檢測(cè) PIK3R1基因甲基化水平的試劑。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中可用于檢測(cè)基因甲基化程度或者頻率的方法包括但不限于全基因組 甲基化檢測(cè)技術(shù)，如基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化篩選、基于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲基化 圖譜分析，特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)技術(shù)，如甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸鹽處理后的基因組 測(cè)序法（BSP)、聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA)、甲基化特異性內(nèi)切酶酶切和 定量聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合法（MSRED-qPCR)、熒光定量法（Methylight)、甲基化敏感性高分辨 率熔解曲線分析法（MS-HRM)、焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing)。因此檢測(cè)PIK3R1基因甲 基化的試劑包括利用上述方法檢測(cè)PIK3R1基因甲基化水平時(shí)所需的試劑。
[0016] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，檢測(cè)PIK3R1基因甲基化水平時(shí)所需的試劑包括擴(kuò) 增包含甲基化位點(diǎn)在內(nèi)的PIK3R1基因片段的引物序列，所述引物序列如下所示：
[0017] 5'端引物：
[0018] aggaagagagTGTTTTTTTTAATGTGGTATATTTGTGA ；
[0019] 3'端引物：
[0020] cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAAAATATCACCAAACCACTCCTACo
[0021] 本發(fā)明還提供了低甲基化基因 PIK3R1在制備胎兒宮內(nèi)生長受限治療藥物中的應(yīng) 用。所述藥物能夠通過提高PIK3R1基因的甲基化水平從而治療胎兒宮內(nèi)生長受限。
[0022] 進(jìn)一步，所述藥物的活性成分為PIK3R1基因甲基化促進(jìn)劑，所述PIK3R1基因甲基 化促進(jìn)劑能夠提高PIK3R1基因的甲基化水平。
[0023] 所述甲基化促進(jìn)劑可以是能夠激活DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT)的物質(zhì)，也可以是能 夠抑制基因去甲基化酶的物質(zhì)、或者是上述兩者的組合。
[0024] 本發(fā)明還提供了 PIK3R1基因甲基化促進(jìn)劑在制備胎兒宮內(nèi)生長受限治療藥物中 的應(yīng)用，所述PIK3R1基因甲基化促進(jìn)劑能夠提高PIK3R1基因的甲基化水平。
[0025] 進(jìn)一步，所述甲基化促進(jìn)劑可以是能夠激活DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT)的物質(zhì)，也 可以是能夠抑制基因去甲基化酶的物質(zhì)、或者是上述兩者的組合。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療胎兒宮內(nèi)生長受限的藥物組合物，所述藥物組合物 包含PIK3R1基因甲基化促進(jìn)劑，所述PIK3R1基因甲基化促進(jìn)劑能夠提高PIK3R1基因的甲 基化水平。所述甲基化促進(jìn)劑可以是能夠激活DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT)的物質(zhì)，也可以是 能夠抑制基因去甲基化酶的物質(zhì)、或者是上述兩者的組合。
[0027] 本發(fā)明的上下文中，所述PIK3R1基因的甲基化水平顯著下調(diào)是指PIK3R1基因平 均甲基化水平顯著下調(diào)。
[0028] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，IUGR組PIK3R1基因-98位 點(diǎn)、-244位點(diǎn)、-332位點(diǎn)甲基化水平均顯著下調(diào)，三個(gè)位點(diǎn)的平均甲基化水平也顯著下調(diào)。
[0029] 本文中"診斷"包括判斷受試者是否已經(jīng)患有胎兒宮內(nèi)生長受限、也包括判斷受試 者是否存在患有胎兒宮內(nèi)生長受限的風(fēng)險(xiǎn)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的研宄成果分析可知，通過檢測(cè)PIK3R1基因的平均甲基化水平，可以 判斷受試者是否患有胎兒宮內(nèi)生長受限，或者可以判斷受試者是否存在患有胎兒宮內(nèi)生長 受限的風(fēng)險(xiǎn)。也可以通過分別檢測(cè)PIK3R1基因-98位點(diǎn)、-244位點(diǎn)、-332位點(diǎn)甲基化水平 來判斷受試者是否患有胎兒宮內(nèi)生長受限，或者可以判斷受試者是否存在患有胎兒宮內(nèi)生 長受限的風(fēng)險(xiǎn)。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0032] 1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 PIK3R1基因甲基化與胎兒宮內(nèi)生長受限相關(guān)，為首創(chuàng)，具有創(chuàng)新 性。
[0033] 2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的胎兒宮內(nèi)生長受限診斷分子標(biāo)志物，可以通過抽取受試者的血液 來檢測(cè)其甲基化水平，具有無創(chuàng)、快速、特異、靈敏的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)