(1)培養(yǎng)液（每升）的配制：①懸浮細(xì)胞：RPMI-1640培養(yǎng)粉一袋（10. 4g)，新生牛 血清100mL，青霉素溶液（20萬U/mL)0. 5mL，鏈霉素溶液（20萬U/mL)0. 5mL，加三蒸水溶解 后，用5. 6%的NaHCO3溶液調(diào)PH值至7. 2-7. 4,最后定容至1000mL。過濾滅菌。②貼壁細(xì) 胞：同上，再加入 NaHCO3 2. 00g，HEPES 2. 38g。
[0081] (2)D-Hanks 緩沖液（每升）的配制：NaCl 8. 00g，KCl 0· 40g，Na2HPO4 · 12H20 0· 06g，KH2PO4 0· 06g，NaHCO3 0· 35g。高壓滅菌。
[0082] (3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks緩沖液配成濃度為0. 5%胰蛋白酶液。過濾 除囷。
[0083] (4)實驗藥液的配制：將測試樣品用少量的三蒸水溶解配成儲備液，一般按實驗 最高濃度的10倍配制儲備液。根據(jù)化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量 DMSO助溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不宜過大，加藥后的每孔細(xì)胞懸液中 DMSO的終濃度一般不超過0. 05% -0. 1%。儲備液保存于-20°C冰箱中備用。
[0084] (5)宮頸癌細(xì)胞（Hela)、肺癌細(xì)胞（A549)、黑色素瘤細(xì)胞（FlO)以及肝癌細(xì)胞 0fepG2)的培養(yǎng)：為懸浮生長細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)（含10%小牛血清、 lOOU/mL鏈霉素），置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。傳代時將原瓶 中培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 rpm離心5min，棄去原培養(yǎng)液，加入等量新鮮培養(yǎng)液，吹打 均勻，移取適量至新鮮培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液至原體積（培養(yǎng)液體積約為培養(yǎng)瓶容 量的1/10)。
[0085] (6)細(xì)胞孵育：取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液濃度為1-1. SXioWmL' 在96孔培養(yǎng)板中每孔加細(xì)胞懸液100 μ L，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后， 分別按設(shè)計加入藥液。
[0086] (8)加藥：將測試藥液按照最終濃度的濃度梯度分別加入到各個孔中，每個濃度 設(shè)6個平行孔。實驗分為藥物試驗組（分別加入不同濃度的測試藥）、對照組（只加培養(yǎng)液 和細(xì)胞，不加測試藥）和空白組（只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞和測試藥）。將加藥后的96孔板置 于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。陽性對照藥物的活性按照測試樣品的方法測定。
[0087] (9)存活細(xì)胞的測定：在培養(yǎng)了 48h后的96孔板中，每孔加 MTT 40 μ L(用D-Hanks 緩沖液配成4mg/mL)。在37°C放置4h后，移去上清液。每孔加150 μ L DMS0,振蕩5min，使 formazan結(jié)晶溶解。最后，利用自動酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔的光密度（0D值）。
[0088] 半數(shù)抑制濃度（IC5tl)定義為當(dāng)50%的腫瘤細(xì)胞存活時的藥物濃度。根據(jù)測定的 光密度（0D值），制作細(xì)胞生長抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其對應(yīng)的藥物濃度。
[0089] 測得的IC5。見表1所示。
[0090] 表1 4- (3- (3- (4-氯香豆素）-酰腙）-5-苯基-吡唑）苯磺酰胺類衍生物對腫瘤 細(xì)胞的抑制IC5tl值（μ M)
[0091]
[0093] a3次平行試驗，實驗結(jié)果取平均值，誤差在5% -10%之間
[0094] 實施例二十二：4-(3-(3-(4-氯香豆素）_酰腙）-5_苯基-吡唑）苯磺酰胺類衍 生物體外抗腫瘤活性關(guān)于細(xì)胞毒性的研宄
[0095] 本發(fā)明測試了新合成化合物83-102對人腎上皮細(xì)胞（293T)的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒 性結(jié)果如表2,以Celecoxib作為陽性對照。每個化合物的毒性用抑制T細(xì)胞存活率到50% 時的濃度（CC 5tl)來表示。
[0096] 實驗方法：
[0097] (1)培養(yǎng)人腎上皮細(xì)胞（293T)直至達(dá)到其對數(shù)生長期末細(xì)胞趨于融合，用細(xì)胞消 化液消化分散細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成X IO4個/mL的細(xì)胞懸液。取96孔培養(yǎng)板，每孔 中加入100 μ L的細(xì)胞懸液。輕輕水平轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地分散在皿孔的表面。
[0098] (2)置于含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37±2°C溫度下培養(yǎng)24h。棄去原培養(yǎng)液，每 孔加入100 μ L的空白對照液，陰性對照液，陽性對照液，100%和50%濃度的試驗樣品浸提 液。每組至少設(shè)8孔。注：浸提原液或以培養(yǎng)基作稀釋劑的系列浸提稀釋液。采用0.9% 氯化鈉注射液浸提時，在稀釋浸提時使用濃縮的2倍培養(yǎng)基。
[0099] (3)置于含5% 0)2培養(yǎng)箱中，在37±2°C溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48h。
[0100] ⑷每個培養(yǎng)間期后，每孔加入MTT溶液20 μ L，置于含5 % 0)2培養(yǎng)箱中，在 37±2°〇溫度下培養(yǎng)511。
[0101] (5)棄去孔內(nèi)液體，每孔分別加入200 μ L DMS0,將培養(yǎng)板放置lOmin，水平振搖 使孔內(nèi)溶液顏色均勻。
[0102] (6)用酶標(biāo)儀測定吸光度，波長采用570nm。
[0103] 測得的CC5tl見表2所示。
[0104] 表2本發(fā)明所列4- (3- (3- (4-氯香豆素）-酰腙）-5-苯基-吡唑）苯磺酰胺類衍 生物對293T細(xì)胞的抑制CC5tl值（μ M)
[0106] a3次平行試驗，實驗結(jié)果取平均值，誤差在5%-10%之間。
【主權(quán)項】
本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 1. 4- (3- (3- (4-氯香豆素）-酰腙）-5-苯基-吡唑）苯磺酰胺類衍生物的合成，其特征 是它有如下通式：一種上述的4- (3- (3- (4-氯香豆素）-酰腙）-5-苯基-吡唑）苯磺酰胺類衍生物的合 成，它由下列步驟組成： 步驟1.在0°C冰浴下將6mL三氯氧磷滴加到12mL二甲基甲酰胺中，然后將溶于二甲基 甲酰胺（6mL)的4-羥基香豆素逐滴加入到上述混合液中，讓反應(yīng)逐漸升到室溫攪拌2h，然 后將反應(yīng)燒瓶轉(zhuǎn)移至60°C油浴鍋中反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用碳酸鈉中 和至pH = 7,過濾，固體依次用冷乙醇（3X50mL)、蒸餾水（3X200mL)洗滌，干燥得原料2 步驟2.在0°C下將甲醇鈉（80mmol)溶于40mL無水甲醇中，然后將各取代基的苯乙 酮3-22(20mmol)與草酸二甲酯（40mmol)溶于40mL無水甲醇中，逐滴加入到甲醇鈉的甲 醇溶液中，將反應(yīng)燒瓶轉(zhuǎn)移到油浴鍋中，回流反應(yīng)6h，TLC跟蹤反應(yīng)（展開劑VAc;()Et :VPE = 1 : 2)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物加到冰水中，lmol/L鹽酸酸化，過濾，固體依次用冷乙醇 (3X50mL)、蒸餾水（3X200mL)洗滌，干燥得原料23-42。 步驟3.在室溫攪拌下，依次向100mL的圓底燒瓶中加入23-42(15_〇1)、對肼基苯磺 酰胺（15_〇1)、無水甲醇（50mL)，將反應(yīng)燒瓶轉(zhuǎn)移到油浴鍋中，回流反應(yīng)6h，將反應(yīng)液倒 入500mL燒杯中，過濾，固體依次用lmol/L鹽酸（3X50mL)、蒸餾水（3X150mL)、冷乙醇 (3X50mL)、蒸餾水（3X100mL)洗絳，干燥得中間體43-62。 步驟4.依次將43_62(8mmol)、無水乙醇（20mL)、水合肼（120mmol)、加入到50mL的 圓底燒瓶中，反應(yīng)燒瓶轉(zhuǎn)移到油浴鍋中，回流反應(yīng)6h，TLC跟蹤反應(yīng)（展開劑VAc;()Et :VPE = 1 : 2)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，固體依次用lmol/L鹽酸（3X100mL)、蒸餾水（3X150mL)、冷乙 醇洗滌（3X50mL)洗滌，干燥，將得到中間物63-82。 步驟5.在室溫攪拌下，依次將63-82 (0. 5mmol)、2 (0. 6mmol)、無水乙醇（20mL)、冰乙酸 (lmL)加入到50mL的圓底燒瓶中，室溫攪拌12h后，將反應(yīng)混合物加入到冰水中，過濾，固體 依次用冷乙醇（3X50mL)、蒸餾水（3X150mL)洗滌，干燥，得到的固體粗產(chǎn)物溶于無水乙醇 重結(jié)晶得到粉末狀目標(biāo)化合物83-102。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的4- (3- (3- (4-氯香豆素）-酰腙）-5-苯基-吡唑）苯磺酰胺類 衍生物的制備方法及在抗癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】4-(3-(3-(4-氯香豆素)-酰腙)-5-苯基-吡唑)苯磺酰胺類衍生物的合成，其特征是它有如下通式：本發(fā)明的4-(3-(3-(4-氯香豆素)-酰腙)-5-苯基-吡唑)苯磺酰胺類衍生物對宮頸癌細(xì)胞(Hela)、黑色素瘤細(xì)胞(F10)以及肝癌細(xì)胞(HepG2)的培養(yǎng)有明顯的抑制作用，同時對人腎上皮細(xì)胞(293T)表現(xiàn)出了相當(dāng)或者優(yōu)于陽性對照藥物的細(xì)胞毒性。因此本發(fā)明的4-(3-(3-(4-氯香豆素)-酰腙)-5-苯基-吡唑)苯磺酰胺類衍生物可以應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明公開了其制法和抗腫瘤生物活性。
【IPC分類】C07D405/12, A61P35/00, A61K31/4155
【公開號】CN104945388
【申請?zhí)枴緾N201510407971
【發(fā)明人】朱海亮, 盧小院, 王忠長, 嚴(yán)曉強(qiáng)
【申請人】南京大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月9日