Mmaf手性異構(gòu)體的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及-種手性化合物的制備方法，特別涉及細(xì)胞有絲分裂抑制劑MMAF手性 異構(gòu)雜質(zhì)的關(guān)鍵中間體的制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海兔毒素10 (dolastatinlO, D10)是從海洋無殼軟體動物截尾海兔（Dolabella auricularia)中分離提取的由4個(gè)氨基酸組成的線性縮肽類天然毒性蛋白。MMF是海兔毒 素10(dolastatinl0，D10)的衍生物，可以抑制細(xì)胞有絲分裂，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。其 與腫瘤靶向抗體偶聯(lián)形成的抗體偶聯(lián)藥物已進(jìn)入臨床研究階段。
[0003] MMAF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)由 5 個(gè)單體構(gòu)成：MeVal、Val、Dil、Dap、Phe。
[0004]
[0005] MMAF的全合成工藝是將三肽片段MeVal-Val-Dil與二肽片段Boc-Dap-Phe縮合 而成的。其中關(guān)鍵單體Boc-Dolaproine (Dap)有三個(gè)手性中心，在合成過程中會產(chǎn)生4個(gè) 手性異構(gòu)體，但只有2S，2' R，3' S型Dap才能與MeVal、Val、Dil、Phe制備出具有生物活性 的MMAF，其他3種構(gòu)型的Dap會在MMAF全合成工藝中形成相應(yīng)的手性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的控 制和檢驗(yàn)對MMAF的臨床應(yīng)用具有關(guān)鍵的影響。因此對MMAF關(guān)鍵二肽中間體Boc-Dap-Phe 手性異構(gòu)體的合成進(jìn)行研究，獲得異構(gòu)體雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，對實(shí)現(xiàn)MMAF藥學(xué)研究中手性純度的 控制和檢驗(yàn)，具有重要的價(jià)值。
[0006]
[0007] 在 Dap 合成過程中 Boc-(2S，2^ R，3^ R)_Dapl 與（2S，2^ S，3^ R)_Dap2 可以 通過正向?qū)游龇▽?shí)現(xiàn)分離，但由于Boc-OSJ' R，3' S)-is〇-Dap3與Boc-OSJ' S， 3' S)-is〇-Dap4在正向?qū)游鱿到y(tǒng)里的極性極為相似，很難通過常規(guī)的分離方法獲得。因此 這兩個(gè)對映異構(gòu)體的制備方法很少有人報(bào)道，盡管Ce line Mordant等曾有嘗試將這對手 性對映異構(gòu)體分離，但并未成功（Tetrahedron60 (2004) 97159723)。因此目前還沒有一種能 夠獲得由3或4作為單體的MMAF手性雜質(zhì)14、15標(biāo)準(zhǔn)品的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對MMAF手性異構(gòu)雜質(zhì)合成中存在的上述問題，提供一種制備 MMAF手性異構(gòu)雜質(zhì)的方法。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種制備MMAF手性異構(gòu)雜質(zhì)的方法，所述 制備方法包括以下步驟：
[0010] 步驟一、Boc-(2S，2' R，3' S)-is〇-Dap，10a 與 Boc-(2S，2' S，3' S)-is〇-Dap， IOb的混合物10與L-苯丙氨酸甲酯11縮合制備獲得二肽消旋化合物12 ;
[0011] 步驟二、通過常規(guī)硅膠柱正向?qū)游龇蛛x方法分別獲得高純度的12a和12b ;
[0012] 步驟三、化合物12a與12b分別與三肽片段MeVal-Val-DiL 13縮合制備獲得MMAF 對映異構(gòu)體雜質(zhì)14和15 ;
[0013] 其中，MMAF對映異構(gòu)體雜質(zhì)14的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
[0014]
[0017] 其中，所述步驟一的具體反應(yīng)條件是：所述混合物10, Boc-Dap-OH溶于二氯甲烷 和二甲基甲酰胺的混合溶液中，加入2-4當(dāng)量的二異丙基乙胺，1-2當(dāng)量的2-(7-偶氮苯并 三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯，1-2當(dāng)量的L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽11，得 到所述混合物12。
[0018] 其中，所述步驟二的具體條件為：通過濕法上樣，分離展開劑為石油醚：乙酸乙酯 =6 :1，硅膠柱正向?qū)游龇蛛x得到所述12a和12b。
[0019] 其中，所述步驟三的具體條件為：將1當(dāng)量的Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH分別和 1當(dāng)量的化合物12a或12b溶解于二氯甲烷中，然后加入2. 2當(dāng)量的N，N-二異丙基乙胺； 加入1. 5當(dāng)量焦碳酸二乙酯，將反應(yīng)物濃縮成油狀物，用硅膠層析純化，用正己烷：乙酸乙 酯=5 :1洗脫，分離得到所述MMAF雜質(zhì)14或15。
[0020] 本發(fā)明以易制備的或商業(yè)上可得的N-(tert_butoxycarbonyl)-(S)-prolinal， 5 (其制備參考文獻(xiàn) J. Am. Chem. S0C. 1960,82,681，Τ· TetrahedronLett. 1986, 27, 3577)和 丙烯酸甲酯6為原料，經(jīng)Baylis Hillman反應(yīng)，獲得（2S，3< R和2S，3' S)異構(gòu)體混合的 甲酯化合物7,采用正向?qū)游龇椒ㄌ幚砘衔?獲得2S，3' S-甲酯化合物8。化合物8在 常溫常壓下，經(jīng)鈀碳催化還原得到手性構(gòu)型為2S，3' S，2' R的化合物9a與手性構(gòu)型為 2S，3' S，2' S的化合物9b的混合物9,其中9a和9b的占比分別為1:1 (其制備參考文獻(xiàn) TetrahedronLett. 2003,937)?；旌衔?9 進(jìn)一步與 MeO3BF4 反應(yīng)上甲基，再于 LiOH-H20/THF 條件下脫甲基，獲得Boc-(2S，2' R，3' S)-iso-Dap(IOa)與Boc-(2S，2' S，3' S)-iso- Dap(IOb)的混合物10,文獻(xiàn)報(bào)道（Tetrahedron60(2004)97159723)和我們的實(shí)踐均證明 IOa和IOb無法通過硅膠層析實(shí)現(xiàn)分離。
[0021] 以上化學(xué)反應(yīng)的方程式如下：
[0022]
[0023] 本發(fā)明通過將消旋化合物10與相應(yīng)的L-苯丙氨酸甲酯11縮合制備獲得二肽消 旋化合物12,增強(qiáng)了兩種手性異構(gòu)體12a和12b的極性差異，從而可以通過常規(guī)硅膠柱正向 層析分離方法分別獲得高純度12a和12b，12a(98. 83% )和12b (96. 32% )收率達(dá)到60%。 化合物12a與12b分別與三肽片段MeVal-Val-Dil (13)縮合制備獲得MMAF對映異構(gòu)體雜 質(zhì)（14,15)。
[0024] 以上反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如下：

[0027] 化合物12的具體制備條件如下：
[0028] (1) 12 的合成
[0029] Boc-Dap-OH(IO)溶于二氯甲烷（DCM)和二甲基甲酰胺（DMF)的混合溶液中， 加入2.0-4. 0當(dāng)量二異丙基乙胺（DIEA)，1.0-2. 0當(dāng)量2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N， Ν'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)，1.0-2.0當(dāng)量L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽（11， H-Phe-OMeHCl)，通過LC-MS或TLC檢測反應(yīng)，反應(yīng)得到化合物12。
[0030] (2) 12a和12b的分離條件
[0031] 將化合物12通過濕法上樣，分離展開劑為石油醚：乙酸乙酯=6 :1，硅膠柱正向?qū)?析分離得到兩種手性的Boc-Dap-Phe-OMe。
[0032] MMAF異構(gòu)體雜質(zhì)I (14)和雜質(zhì)II (15)的具體制備方法如下：
[0033] 將Fmoc-MeVal+Val-Dil-〇H(l當(dāng)量）和化合物12a或12b(l當(dāng)量）溶解于二氯甲 烷中，然后加入N，N-二異丙基乙胺（2.2當(dāng)量）。加入焦碳酸二乙酯（1.5當(dāng)量），將反應(yīng)物 置于氮?dú)庵?。根?jù)LC-MS分析結(jié)果，跟蹤反應(yīng)。將混合物濃縮成油狀物，用Si02層析純化， 用正己烷：乙酸乙酯=5 :1洗脫，分離得到MMAF雜質(zhì)1(14)或雜質(zhì)11(15)。
[0034] MMAF雜質(zhì)1(14)或雜質(zhì)11(15)是以MMAF關(guān)鍵中間體的手性異構(gòu)體Boc-(2S， 2' R，3' S)-is〇-Dap3與Boc-OSJ' S，3' S)-is〇-Dap4作為單體，因此分離制備出純度 高、收率高的雜質(zhì)14和15,對于制備MMF雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品有決定性的作用，從而也為檢驗(yàn)MMF 中雜質(zhì)的濃度，提高M(jìn)MAF藥物純度提供了關(guān)鍵條件。
[0035] 本方法首次制備出了 MMAF的手性異構(gòu)雜質(zhì)的關(guān)鍵中間體，從而為MMAF藥物 純度的檢驗(yàn)和提商打下基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明無需使用Ti、Sn、Co、釘、綱等貴金屬，或 (S)-SYNPH0S?等昂貴的手性催化劑,也不使用價(jià)格昂貴的手性柱,無需無水無氧等嚴(yán)格 的反應(yīng)條件，工藝流程簡單，反應(yīng)條件溫和，輕松實(shí)現(xiàn)MMAF手性異構(gòu)體的分離，產(chǎn)率高，成 本低廉，適于工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用，從而能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化制備MMAF雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。
【附圖說明】
[0036] 圖 112a(spl)的 HPLC 圖譜。
[0037] 圖 212a (spl)的 MS 圖譜。
[0038] 圖 312b (SP2)的 HPLC 圖譜。
[0039] 圖 41? (SP2)的 MS 圖譜。
[0040] 圖512a和12b混合物的HPLC圖譜。
[0041] 圖6MMAF雜質(zhì)I (14)與MMAF標(biāo)準(zhǔn)品對照的UHPLC圖譜。
[0042] 圖 7MMAF 雜質(zhì) I (14)的 MS 圖譜。
[0043] 圖8MMAF雜質(zhì)II (15)與MMAF標(biāo)準(zhǔn)品對照的UHPLC圖譜。
[0044] 圖 9MMAF 雜質(zhì) II (15)的 MS 圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附后權(quán)利要求書限定的范 圍。
[0046] 實(shí)施例1，化合物8的制備
[0047] N-Boc-L-脯氨醛（5g)溶于100mL二氯甲烷，加入丙