Q ID NO :1所示的氨基酸序列，由上海吉爾生化有 限公司合成，該多肽的表征可通過氫譜和質(zhì)譜確認(rèn)合成了所述多肽。液相色譜法檢測純 度：95. 31% (面積歸一法）：質(zhì)譜法檢測（ESI-MS):計(jì)算分子量：2062. 24,測試值2063。
[0065] 2.檢測器件的制各
[0066] 檢測芯片是以SJ改性硅膠（iPDMS薄膜）為固體支撐材料，在其上通過點(diǎn)樣固定 多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面 引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過熱交聯(lián)（硅氫鍵鍵合）固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu) 中，得到SJ改性硅膠，其制作過程如圖1所示。
[0067] 其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個組分，聚二甲基硅氧烷 (Poly(dimethylsiloxane), Sylgard 184)購買自美國道康寧（DowCorning)公司，包含 液態(tài)組分A(成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物）和交聯(lián) 劑B(成分為帶有乙烯基和Si-H基團(tuán)的二甲基硅氧烷前體）兩種成分。C為末端帶乙 烯基的引發(fā)劑，購于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單 體（01igo(ethylene glycol)methacrylate，以下簡稱 OEGMA，分子量 Mw = 526)購買于 Aldrich。將聚二甲基硅氧烷前體A和交聯(lián)劑B與帶乙烯基末端的引發(fā)劑C以A :B:C= 10 : 1 :〇. 5比例充分混合。通過固化反應(yīng)制成透明的彈性硅橡膠，然后通過SIP技術(shù)進(jìn)行表面 修飾即可得到SJ改性硅膠。實(shí)驗(yàn)表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、通過共價鍵固 定的引發(fā)劑，其可以通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)（SIP)實(shí)現(xiàn)表面高分子修飾。使用poly(OEGMA) (聚乙二醇甲基丙烯酸酯）進(jìn)行反應(yīng)獲得聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG)修飾的表 面，實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0068] 制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0069] 采用晶芯?:PersonalArrayerTM I6個人點(diǎn)樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列， 過程為：
[0070] 1)預(yù)處理
[0071] 將SJ改性硅膠薄片（15X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗 3次，用氮?dú)獯蹈?，馬上用于點(diǎn)樣。
[0072] 2)點(diǎn)樣
[0073] 將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣 儀基臺上，同時將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條 件為室溫（25°C )，濕度設(shè)定為50%。制成的多肽微陣列上每個點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0. 6nL，樣 點(diǎn)半徑為200 μ m。
[0074] 3)化學(xué)固定
[0075] 剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱（26°C，60%濕度）中固定至少6h?；瘜W(xué) 固定過程如下：
[0076] 首先通過點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖 液開始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過化學(xué)結(jié)合，改性 硅膠表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-COOH與多肽分子的-一順2形成穩(wěn)定共價鍵，進(jìn)而 將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。
[0077] 4)裝配
[0078] 固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過背膠將SJ改性硅膠薄片貼 在專門的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個反應(yīng)器由兩個反應(yīng)柱和一個反應(yīng)腔體組成。
[0079] 5)保存
[0080] 裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0081] 3.用檢測器件講行檢測
[0082] 檢驗(yàn)步驟
[0083] 1、開始檢測前，將濃縮洗液按1 :10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋完 成后得洗液，直接使用，使用移液槍將2mL洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表 面被完全浸潤。
[0084] 2、將待測血清樣本用樣本稀釋液按照1 :40稀釋混勻。
[0085] 3、棄去浸泡芯片的洗液，在芯片表面完全濕潤的狀態(tài)下，每個血清樣本吸取 200 μ L稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。
[0086] 4、將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫 孵育30分鐘。
[0087] 5、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
[0088] 6、清洗完成后，每個芯片反應(yīng)器分別加入200 μ L酶標(biāo)二抗溶液，將芯片反應(yīng)器放 入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0089] 7、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)二抗溶液，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3 次。
[0090] 8、可預(yù)先將發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B以等體積混合均勻，得發(fā)光底物混合溶 液（45分鐘內(nèi)使用）。待清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個芯片表面分別加入15 μ L發(fā)光底 物混合溶液，使發(fā)光底物混合溶液能均勻的鋪于芯片表面。
[0091] 9、將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像，并判讀結(jié)果。
[0092] 健康正常人血清、腸道病毒71型感染病人血清及其他疾病病人血清樣本由合作 醫(yī)院提供，疾病標(biāo)準(zhǔn)均經(jīng)過臨床檢驗(yàn)確證，均獲得了提供者的知情同意書。
[0093] 陰性對照有PBS緩沖液（即在第3步中不用待測血清孵育，而用PBS溶液孵育，其 余步驟相同）的對照，血清稀釋液的對照，及陰性血清（指健康人及非腸道病毒71型感染 病人的血清）的對照。
[0094] 多肽微陣列的點(diǎn)樣模式如圖2所示：其中，黑色圓形的16個點(diǎn)的樣本為人IgG，作 為定位點(diǎn)；正方形的4個點(diǎn)的樣本為PB點(diǎn)樣液，作為實(shí)驗(yàn)的空白對照；白色圓形點(diǎn)的樣本 是其他的腸道病毒71型自身抗原蛋白多肽，作為檢測指標(biāo)（這些多肽有響應(yīng)說明被檢測的 血清中有腸道病毒71型自身抗體）；星形點(diǎn)的樣本多肽為本發(fā)明的多肽，它是腸道病毒71 型自身抗原蛋白多肽，會對腸道病毒71型感染患者血清產(chǎn)生響應(yīng)。
[0095] 使用該多肽微陣列按照上述檢測步驟對腸道病毒71型感染病人血清及陰性對照 進(jìn)行了檢測，響應(yīng)模式如圖3~4所示：其中，圖3顯示了陰性對照的檢測結(jié)果，只有黑色 圓形所示的點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖4顯示了腸道病毒71型感染病人血清的檢測結(jié)果，黑色圓 形、白色圓形和星形點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。需要說明的是，儀器測得信號值由低到高，相應(yīng)的信 號點(diǎn)顏色由黑一紅一白漸變。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，即：EQGVSDHKGLGDAFGTGFT。2. -種檢測器件，其包括： 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器件，其用于腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷。5. -種檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求2~4中任一項(xiàng)所述的檢測器件。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，其用于腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診 斷。7. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備檢測試劑盒中的用途。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒用于腸道病毒71型抗體IgG的 臨床輔助診斷。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒包括權(quán)利要求2~4中任一項(xiàng)所 述的檢測器件。
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽、包含多肽的檢測器件、以及包含檢測器件的診斷試劑盒。將本發(fā)明應(yīng)用于腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【IPC分類】G01N33/569, C07K7/08, G01N33/68
【公開號】CN104945474
【申請?zhí)枴緾N201410851611
【發(fā)明人】馬雄明
【申請人】蘇州偲聚生物材料有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2014年12月31日