多肽、包含該多肽的檢測器件和包含該器件的檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領域，特別是可用于腸道病毒71型的臨床輔助診斷的多肽、 包含該多肽的檢測器件的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腸道病毒71型（Human enterovirus 71)，簡稱EV71，是引起嬰幼兒手足口病 (hand-foot and mouth disease ;HFMD)主要病原體之一。人類腸病毒71型于1969年首 次從加利福尼亞患有中樞神經系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。
[0003] EV71主要引起手足口病，還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻 痹等多種神經系統(tǒng)疾病。手足口病和中樞神經系統(tǒng)感染是EV71感染而引起的兩大常見臨 床癥狀。病毒從咽部或腸道侵入，在局部黏膜或淋巴組織中繁殖，并由局部排出，此時可引 起局部癥狀。繼而病毒又侵入局部淋巴結，并由此進入血液循環(huán)導致第一次病毒血癥。病毒 經血循環(huán)侵入網狀內皮組織、深層淋巴結、肝、脾、骨髓等處大量繁殖并由此進入血液循環(huán)， 引起第二次病毒血癥。病毒可隨血流進入全身各器官，如中樞神經系統(tǒng)、皮膚黏膜、心臟等 處，進一步繁殖并引起病變。易感者感染EV71后，出現血管變態(tài)反應和組織炎癥病變。當 病毒累及中樞神經系統(tǒng)時，組織炎癥較神經毒性作用更加強烈，中樞神經系統(tǒng)小血管內皮 最易受到損害。細胞融合、血管炎性變、血栓形成可導致缺血和梗死。在脊髓索、腦干、間 腦、大腦和小腦的局部組織中，除嗜神經性作用外，還存在廣泛的血管周圍和實質細胞炎癥 道病毒71型危害極大，目前急需簡便快捷準確的儀器是實現對其的快速檢測。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種多肽、包含該多肽的檢測器件、以及包含該檢測器件 的檢測試劑盒，它們對腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診 斷是有用的。本發(fā)明目的在于提供該多肽在制備可用于腸道病毒71型診斷的檢測試劑盒 中的用途。
[0005] 即，本發(fā)明包含下述技術方案：
[0006] 1. 一種多肽，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :1 所示，即：EYGLTMTPADKSPCFNEVNW。
[0007] 2. -種檢測器件，其包括：
[0008] 固體載體，以及
[0009] 連接于該固體載體上的權利要求1所述的多肽。
[0010] 3.根據權利要求2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0011] 4.根據權利要求2所述的檢測器件，其用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒 71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0012] 5. -種檢測試劑盒，其包括權利要求2~4中任一項所述的檢測器件。
[0013] 6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病 毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0014] 7.權利要求1所述的多肽在制備檢測試劑盒中的用途。
[0015] 8.根據權利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒用于腸道病毒71型抗體 IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0016] 9.根據權利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒包括權利要求2~4中任一 項所述的檢測器件。
[0017] 將本發(fā)明應用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助 診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【附圖說明】
[0018] 圖1對SJ改性硅膠（iPDMS薄膜）的制作過程進行說明的示意圖。
[0019] 圖2說明腸道病毒EV71型IgM多肽微陣列的點樣模式的示意圖。
[0020] 圖3說明腸道病毒EV71型IgM多肽微陣列的點樣模式的示意圖。
[0021] 圖4顯示對健康正常人或非腸道病毒71型感染病人血清進行檢測的結果的照片。
[0022] 圖5顯示對腸道病毒71型感染病人血清中的抗體IgM進行檢測的結果的照片。
[0023] 圖6顯示對腸道病毒71型感染病人血清中的抗體IgG進行檢測的結果的照片。
[0024] 發(fā)明的【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明的多肽
[0026] 在另一個方面中，本發(fā)明提供對對腸道病毒71型的早期篩查和臨床輔助診斷有 用的多肽，由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列構成，即：EYGLTMTPADKSPCFNEVNW。如實施例 所示，本發(fā)明的多肽對腸道病毒71型感染病人的血清呈陽性反應，而對健康正常人或非腸 道病毒71型感染病人血清呈陰性反應。因此，本發(fā)明的多肽作為腸道病毒71型抗體IgM 或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷工具是有用的。本發(fā)明的多肽可以用于制造 可用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG臨床輔助診斷的檢測器件（例 如下述的本發(fā)明的檢測器件）或檢測試劑盒（例如下述的本發(fā)明的檢測試劑盒）。
[0027] 本發(fā)明的多肽可以適宜采用（1)化學合成方法、或（2)酶反應合成方法等公知方 法來獲得，但不限于此，其中化學合成更為簡便。在化學合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使 用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進行。作為化學合成方法，可以列舉出例如肽固相合 成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜 等進行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術領域公知的。
[0028] 此外，在通過酶反應生產本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子 W02004/011653號所述的方法。即，可以這樣來生產：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸（例如羧基保護的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進行反應，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0029] 而且，除了上述的酶方法、化學合成方法以外，還可以采用例如基因工程方法來生 產本發(fā)明的多肽。
[0030] 本發(fā)明的多肽的氨基酸序列可以采用常規(guī)的方法進行分析和確認，例如可以利用 質譜、色譜等方法來進行分析和確認。
[0031] 本發(fā)明的檢測器件
[0032] 在另一方面中，本發(fā)明還提供一種檢測器件（本發(fā)明的檢測器件），其包括固體載 體、以及連接于該固體載體上的本發(fā)明的蛋白質或本發(fā)明的多肽。所述檢測器件對于腸道 病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG臨床輔助診斷是有用的。
[0033] 在本發(fā)明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料（例如是 可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應混合物中分離的材料）的載體即可。
[0034] 構成固體載體的材料包括但不限于：硅膠（聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟 隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、 聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵 氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白（白蛋白等）、碳或它們的組 合等。
[0035] 固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳 納米管、傳感器芯片等。正如本技術領域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設 置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0036] 在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25nm~約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實施方式 中，磁珠具有約50nm~約10 μ m范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0037] 在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μm~約 165 μ m范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24 μ m~約44 μ m范圍的直徑。 高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0038] 具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA或 Spherotech，Liberville，IL購買的制品等聚苯乙稀膠乳珠。
[0039] 二氧化硅（SiO2)-處理或二氧化硅（SiO2)基的固體載體的例子包括可從 Polysciences，Warrington，PA購買的超常磁性二氧化娃珠等，其可以用于捕捉核酸（例如 DNA)。或者，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。
[0040] 具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為 該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington，PA銷售的珠子（名稱：Biomag (注 冊商標）羧基）、或者 Bangs Laboratory，Inc.，Fishers，IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子。 或者，可以使用Dynal Biotech銷售的M-270等。
[0041] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠，其是蘇州傯聚生 物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質的微陣列固體支撐材料（iPDMS薄膜，參見中國專 利公開CN101265329A)。這種材料是以生物學研宄常用的PDMS為基礎，在其中加入特定的 引發(fā)劑成分（使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應（SIP)實現表面功能化修飾），再經過聚乙 二醇甲基丙稀酸醋（p〇ly(〇lig〇(ethylene glycol)methacrylate)，pOEGMA)表面修飾獲得 的。SJ改性硅膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質非特異性吸