植物耐逆性相關(guān)蛋白TaAREB3及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域,涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaAREB3及其編碼 基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 非生物脅迫如干旱、極端溫度和鹽堿等嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。其中干旱和 低溫是影響世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素,也是制約小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。
[0003] 在逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng),伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的 變化。明確植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)制,將為抗逆基因工程研宄和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前,植 物抗逆性研宄已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平,并與遺傳學(xué)和遺傳工程研宄相結(jié)合,探索用生 物技術(shù)來(lái)改進(jìn)植物生長(zhǎng)特性,其目的是提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。
[0004] 因此,利用現(xiàn)代分子生物技術(shù),發(fā)掘抗逆關(guān)鍵基因,通過(guò)基因工程改良小麥抗逆 性,對(duì)于保障國(guó)家糧食安全具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaAREB3及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的TaAREB3蛋白來(lái)源于小麥(Triticum aestivum L.)品種旱選10 號(hào),具體可為如下(a)或(b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);
[0008] (b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加,且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 為了便于上述(a)中所示蛋白質(zhì)的純化,可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序 列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0010] 表:標(biāo)簽的序列
[0011]
[0012] 上述(b)中的蚩白質(zhì)可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的密碼子,和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。
[0013] 編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA,如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因,所述基 因具體可為如下1)或2)或3)的DNA分子:
[0016] 1)序列表中序列2所示的DNA分子;
[0017] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0018] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的 DNA分子。
[0019] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC,0. 5% SDS的溶液,在65°C下雜交,然后用2XSSC, 0· 1 % SDS 和 I X SSC,0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0020] 其中,序列2由933個(gè)核苷酸組成,第1-933位為0RF,編碼序列表中序列1所示的 蛋白質(zhì)。
[0021] 含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0022] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體,也可為重組克隆載體。
[0023] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元 農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等,如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域,即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加 工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí),在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、 組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛素基因 Ubiquitin 啟動(dòng)子(pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等,它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合 使用;此外,使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí),還可使用增強(qiáng)子,包括翻譯增強(qiáng)子或 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等,但必需與 編碼序列的閱讀框相同,以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的 來(lái)源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選,可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行 加工,如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因,直接以逆境 篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024] 在本發(fā)明中,所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為35S啟動(dòng) 子。
[0025] 更為具體的,所述重組表達(dá)載體為在PCAMBIA1300-GFP載體的多克隆位點(diǎn)處插入 所述基因后得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆位點(diǎn)具體為Xba I和Spe I。
[0026] 所述pCAMBIA1300-GFP載體的構(gòu)建方法如下:以pCAMBIA1300為原始載體,在其多 克隆位點(diǎn)插入2個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子,得到中間載體;然后在所述中間載體的Kpn I和Sac I位點(diǎn)間插入GFP的開(kāi)放閱讀框,最終得到所述pCAMBIA1300-GFP載體。
[0027] 其中,所述中間載體具體為在pCAMBIA1300載體的酶切位點(diǎn)Bam H I和Xba I之 間插入序列3所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。所述GFP的開(kāi)放閱讀框的序列具體為序列 表中序列4。所述pCAMBIA1300-GFP載體具體為在所述中間載體的Kpn I和Sac I位點(diǎn)間 插入序列4所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0028] 所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子,所述基因,以及轉(zhuǎn)錄終止序列組 成。
[0029] 所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在 如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0030] (a)調(diào)控植物耐逆性;
[0031 ] (b)選育耐逆性提尚的植物品種;
[0032] (c)調(diào)控植物對(duì)ABA的耐受性;
[0033] (d)選育對(duì)ABA的耐受性降低的植物品種。
[0034] 在(a)中,所述調(diào)控植物的耐逆性具體體現(xiàn)在:在所述植物體內(nèi),若所述基因的表 達(dá)量越高,則所述植物的耐逆性越強(qiáng);若所述基因的表達(dá)量越低,則所述植物的耐逆性越 弱。
[0035] 在(c)中,所述調(diào)控植物對(duì)ABA的耐受性具體體現(xiàn)在:在所述植物體內(nèi),若所述基 因的表達(dá)量越高,則所述植物對(duì)ABA的耐受性越弱;若所述基因的表達(dá)量越低,則所述植物 對(duì)ABA的耐受性越強(qiáng)。
[0036] 在(b)中,所述選育耐逆性增強(qiáng)的植物品種的方法,具體可包括將所述基因表達(dá) 量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0037] 在(d)中,所述選育對(duì)ABA的耐受性降低的植物品種的方法,具體可包括將所述基 因表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0039] 本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法,具體可包括如下(al)和(a2)的步驟:
[0040] (al)向受體植物中導(dǎo)入所述蛋白質(zhì)的編碼基因,得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因 植物;
[0041] (a2)從步驟(al)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述受體植物相比,具有如下(bl)和 (b2)所示性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物:
[0042] (bl)耐逆性提高;
[0043] (b2)對(duì)ABA的耐受性降低。
[0044] 所述蛋白質(zhì)在所述轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量高于所述受體植物;編碼所述蛋白質(zhì)的 基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子:
[0045] 1)序列表中序列2所示的DNA分子;
[0046] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子;
[0047] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子。
[0048] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC,0. 5% SDS的溶液,在65°C下雜交,然后用2XSSC, 0· I % SDS 和 I X SSC,0· I % SDS 各洗膜一次。
[0049] 所述基因具體可通過(guò)上述任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中,得到所述 轉(zhuǎn)基因植物。具體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、 電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織,并 將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0050] 在上述應(yīng)用或方法中,所述耐逆性為如下中的至少一種:耐旱性、耐凍性。
[0051] 在上述應(yīng)用或方法中,所述植物可為單子葉植物,也可為雙子葉植物。如:小麥、煙 草或擬南芥等。
[0052] 在本發(fā)明中,所述植物為擬南芥,具體為擬南芥哥倫比亞0型(Clo-O)。
[0053] 所述蛋白質(zhì)在作為轉(zhuǎn)錄因子中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054] 所述蛋白質(zhì)在作為轉(zhuǎn)錄因子中的應(yīng)用可體現(xiàn)為如下中至少一種:(al)所述蛋白 質(zhì)能夠在體外與ABRE順式作用元件結(jié)合;(a2)在ABA處理下,所述蛋白質(zhì)能夠激活RD29A、 RD29B、C0R15A和/或C0R47基因的表達(dá);(a3)所述蛋白質(zhì)能夠與RD29A、RD29B、C0R15A、 C0R47基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
[0055] 在本發(fā)明中,所述植物對(duì)ABA的耐受性具體體現(xiàn)為種子萌發(fā)對(duì)ABA的耐受性。
[0056] 實(shí)驗(yàn)證明,將可表達(dá)序列表中序列2所示DNA分子的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南