核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒和核酸擴(kuò)增裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒和核酸擴(kuò)增裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著基因的利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療備受 關(guān)注，此外，在農(nóng)牧業(yè)領(lǐng)域也開發(fā)了很多將基因用于品種辨別、品種改進(jìn)的方法。作為利用 基因的技術(shù)，PCR(聚合酶鏈反應(yīng)：Polymerase Chain Reaction)法等核酸擴(kuò)增技術(shù)已廣泛 普及。如今，PCR法在生物物質(zhì)的信息解析中已成為不可或缺的技術(shù)。
[0003] PCR法中，一般是使用稱為管、芯片（以下，稱為生物芯片）的用于進(jìn)行生化反應(yīng)的 容器來進(jìn)行反應(yīng)的方法。然而，在現(xiàn)有的方法中存在如下問題：所需的試劑等的量多，并且 為了實(shí)現(xiàn)反應(yīng)所需的熱循環(huán)而裝置變得復(fù)雜，反應(yīng)耗費(fèi)時間。因此，需要使用微量的試劑、 樣品以短時間進(jìn)行PCR的生物芯片、反應(yīng)裝置。
[0004] 為了解決這樣的問題，專利文獻(xiàn)1公開了一種生物芯片和裝置：在填充有不與反 應(yīng)液混合且比重與反應(yīng)液不同的液體（礦物油等）的管中，使以液滴的狀態(tài)含有的反應(yīng)液 往返移動來實(shí)施熱循環(huán)，從而進(jìn)行反應(yīng)。
[0005] 然而，將專利文獻(xiàn)1中公開的生物芯片用于從容器外部進(jìn)行熒光測定來檢測擴(kuò)增 產(chǎn)物這樣的用途時，需要用透明的材料形成容器。作為透明的材料，可舉出樹脂、耐熱玻璃， 這些材料容易因摩擦等而帶電。雖然只要對容器的內(nèi)表面實(shí)施親水處理就能夠抑制帶電， 但作為水溶液的反應(yīng)液會附著于容器而妨礙移動，因此難以對生物芯片采用親水處理。
[0006] 另一方面，作為不與反應(yīng)液混合且比重與反應(yīng)液不同的液體，從對熱、反應(yīng)液的穩(wěn) 定性的觀點(diǎn)出發(fā)，可以使用硅油、礦物油，但這些油通常是絕緣體，因此導(dǎo)入到油中的反應(yīng) 液的液滴容易極化。因此，如果在透明材料的容器中填充油并導(dǎo)入反應(yīng)液，則有時在反應(yīng)液 與容器之間產(chǎn)生電場，反應(yīng)液被吸引而附著于容器的內(nèi)壁，或者因排斥而懸浮于油中。在 這種狀態(tài)下，如果進(jìn)行在生物芯片中像專利文獻(xiàn)1所記載的依靠重力使反應(yīng)液移動的方式 (以下，在本說明書中，將該方式稱為"升降型"）的PCR，則有時反應(yīng)液無法適當(dāng)?shù)匾苿?，無 法實(shí)施所希望的熱循環(huán)。
[0007] 專利文獻(xiàn)2中公開了一種生物芯片：為了消除生物芯片所產(chǎn)生的電荷，對反應(yīng)液 實(shí)施穩(wěn)定的熱循環(huán)，在使用填充有不與反應(yīng)液混合的液體的容器時，使上述液體的體積固 有電阻大于0Ω .cm且小于等于5 XlO13 Ω .cm。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1:日本特開2009-136250號公報
[0011] 專利文獻(xiàn)2:日本特開2012-125169號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 然而，即使像專利文獻(xiàn)2那樣防止帶電，液滴仍會附著于容器，液滴無法依靠重力 在油中移動，研宄了在核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器內(nèi)的油中加入添加劑的技術(shù)，但添加劑會阻礙 核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器內(nèi)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的活性。因此，本發(fā)明的目的是提供一種以 不阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器內(nèi)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的活性的方式構(gòu)成的核酸擴(kuò)增反應(yīng) 用筒。
[0013] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒，具備管和與上述管連通的核酸 擴(kuò)增反應(yīng)用容器；所述管具有長邊方向，在內(nèi)部具備由與油相分離且從結(jié)合有核酸的微粒 溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的溶出液管芯以及由油和第1添加劑構(gòu)成的第1液體的管芯； 上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器含有由油和第2添加劑構(gòu)成的第2液體，上述第1添加劑選自甲 醇改性有機(jī)硅樹脂、羧基改性有機(jī)硅樹脂、氨基改性有機(jī)硅樹脂、聚醚改性有機(jī)硅樹脂、硅 烷醇改性有機(jī)硅樹脂以及氟改性有機(jī)硅樹脂，上述第2添加劑選自甲醇改性有機(jī)硅樹脂、 羧基改性有機(jī)硅樹脂、氨基改性有機(jī)硅樹脂、聚醚改性有機(jī)硅樹脂、硅烷醇改性有機(jī)硅樹脂 以及氟改性有機(jī)硅樹脂，上述第1液體中含有的第1添加劑濃度高于上述第2液體中含有 的第 2 添加劑的濃度。上述添加劑是 X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、 KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shin-Etsu Silicone 公司），SR1000、SS4230、SS4267、 YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197(以上，Momentive 公司） 中的任一種。上述第1添加劑和上述第2添加劑可以是相同的有機(jī)硅樹脂。另外，將上述 第1液體管芯排出到上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器時的、上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器內(nèi)的上述第 1添加劑的體積與上述第2添加劑的體積的總體積相對于上述第1液體的體積與上述第2 液體的體積的總體積的比例可以為1% (v/v)~20% (v/v)。上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器可 以含有核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑。上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以保持在上述第2液體中。上述核酸 擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以被冷凍干燥。上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以含有表面活性劑，上述表面活 性劑可以是NP40、Triton-XlOO或Tween20。上述容器可以是聚丙烯制。
[0014] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增裝置，安裝有上述任一項的核酸擴(kuò)增反 應(yīng)用筒。
【附圖說明】
[0015] 圖IA和圖IB是筒1的說明圖。
[0016] 圖2A~圖2C是筒1的動作說明圖。
[0017] 圖3A~圖3D是罐3的說明圖。
[0018] 圖4是固定爪25、導(dǎo)板26和安裝部62的說明圖。
[0019] 圖5A和圖5B是PCR容器30的周邊的說明圖。
[0020] 圖6A是PCR裝置50的內(nèi)部構(gòu)成的立體圖。圖6B是PCR裝置50的主要構(gòu)成的側(cè) 視圖。
[0021] 圖7是PCR裝置50的框圖。
[0022] 圖8A是旋轉(zhuǎn)體61的說明圖。圖8B是在旋轉(zhuǎn)體61的安裝部62安裝了筒1的狀 態(tài)的說明圖。
[0023] 圖9A~圖9D是安裝筒1時的PCR裝置50的狀態(tài)的說明圖。
[0024] 圖10是使磁鐵71向下方移動時的磁珠 7的行為的概念圖。
[0025] 圖IlA~圖IlC是核酸溶出處理的說明圖。
[0026] 圖12是使磁鐵71擺動時的磁珠7的行為的概念圖。
[0027] 圖13是表示磁鐵71有無擺動的表。
[0028] 圖14A~圖14C是液滴形成處理的說明圖。
[0029] 圖15A和圖15B是熱循環(huán)處理的說明圖。
[0030] 圖16是表示一個實(shí)施例中使用的核酸提取用試劑盒和其組裝后的裝置的圖。
[0031] 圖17是表示一個實(shí)施例中的實(shí)時PCR的結(jié)果的圖。
[0032] 圖18是表示一個實(shí)施例中的核酸擴(kuò)增溶液的保存穩(wěn)定性能的比較結(jié)果的圖。
[0033] 圖19是表示一個實(shí)施例中的實(shí)時PCR的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下，詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。應(yīng)予說明，本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)以及其構(gòu) 思，根據(jù)本說明書的記載，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的，根據(jù)本說明書的記載，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記載的發(fā)明的實(shí)施方式表示本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施 方式，是為了例示或說明而示出的，本發(fā)明并不限定于此。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說清楚的是 在本說明書中公開的本發(fā)明的意圖以及范圍內(nèi)，可以基于本說明書的記載進(jìn)行各種改變以 及修飾。
[0035] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒，具備管和與管連通的核酸擴(kuò)增 反應(yīng)用容器；所述管具有長邊方向，在內(nèi)部具備由與油相分離且從結(jié)合有核酸的微粒溶出 核酸的溶出液構(gòu)成的溶出液管芯以及由油和第1添加劑構(gòu)成的第1液體的管芯；核酸擴(kuò)增 反應(yīng)用容器含有由油和第2添加劑構(gòu)成的第2液體，第1添加劑選自甲醇改性有機(jī)硅樹脂、 羧基改性有機(jī)硅樹脂、氨基改性有機(jī)硅樹脂、聚醚改性有機(jī)硅樹脂、硅烷醇改性有機(jī)硅樹脂 以及氟改性有機(jī)硅樹脂，第2添加劑選自甲醇改性有機(jī)硅樹脂、羧基改性有機(jī)硅樹脂、氨基 改性有機(jī)硅樹脂、聚醚改性有機(jī)硅樹脂、硅烷醇改性有機(jī)硅樹脂以及氟改性有機(jī)硅樹脂，第 1液體中含有的第1添加劑濃度高于第2液體中含有的第2添加劑的濃度。
[0036] 以下，詳細(xì)敘述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒的構(gòu)成。在說明一般構(gòu)成時，管內(nèi)的第1液體的 管芯也作為油管芯進(jìn)行說明，但在本發(fā)明中，管內(nèi)的任一個以上的油管芯為第1液體的管 芯。
[0037] <筒>
[0038] 圖IA和圖IB是筒1的說明圖。圖2A~圖2C是筒1的動作說明圖。圖2A是筒 1的初始狀態(tài)的說明圖。圖2B是從圖2A的狀態(tài)擠壓柱塞10,密封部件12A接觸下注射筒 22時的側(cè)視圖。圖2C是擠壓柱塞10后的筒1的說明圖。首先，概述該筒的使用方法。
[0039] 筒1由罐3和包含PCR容器30的筒主體9構(gòu)成。在構(gòu)成筒1的試劑盒中，與罐3 和筒主體9 一起預(yù)先準(zhǔn)備適配體5?？赏ㄟ^介由適配體5連接罐3和筒主體9來組裝筒1。 其中，也可以按對筒主體9直接安裝罐3的方式構(gòu)成。
[0040] 在罐3中進(jìn)行核酸提取處理，核酸與磁珠7結(jié)合。管20具有清洗液管芯45、溶出 液管芯47和油管芯。通過使磁鐵沿著管20在外部移動，從而使從罐3進(jìn)入管20的磁珠7 在管20內(nèi)移動而穿過清洗液管芯45,到達(dá)溶出液管芯47。與磁珠7結(jié)合的核酸在清洗液 管芯45中被清洗液清洗并在溶出液管芯47中溶出。
[0041] 熱循環(huán)處理在與管20連通的PCR容器30中進(jìn)行。PCR容器30被第2液體填滿。 溶出液管芯47被從管20推到PCR容器30中時成為液滴狀，成為液滴狀的溶出液47發(fā)生 沉降。在PCR容器30內(nèi)沉降的溶出液47使位于PCR容器30的冷凍干燥的核酸擴(kuò)增反應(yīng) 試劑溶解，成為PCR溶液。在PCR容器30中，利用外部的加熱器形成高溫區(qū)域36A和低溫 區(qū)域36B，通過反復(fù)使筒1整體與加熱器一起上下翻轉(zhuǎn)，液滴狀的PCR溶液在高溫區(qū)域36A 與低溫區(qū)域36B之間交替移動從而被實(shí)施2個階段的溫度處理，進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
[0042] 在以下筒1的詳細(xì)的構(gòu)成要素的說明中，如圖2A所示，以沿長條的筒1的方向?yàn)?"長邊方向"，以罐3側(cè)為"上游側(cè)"，以PCR容器30側(cè)為"下游側(cè)"。應(yīng)予說明，有時也將上游 側(cè)僅表示為"上"，將下游側(cè)表示為"下"。
[0043] (1)罐
[0044] 圖3A~圖3D是罐3的說明圖。
[0045] 在試劑盒中預(yù)先準(zhǔn)備的罐3中收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的開口安裝有 可拆卸的蓋34(參照圖34)。作為溶解液41，使用511硫氰酸胍、2%1'1^〇11乂-100、501111 Tris-HCl (pH7. 2)。操作者取下蓋3A，打開罐3的開口（參照圖3B)，將附著有病毒的棉棒 浸入罐3內(nèi)的溶解液41中，將病毒采集到溶解液41中（參照圖3C)。攪拌罐3內(nèi)的液體 時，可以以圖3C的狀態(tài)振蕩罐3,但這樣溶解液41容易溢出，因此，如圖3D所示，優(yōu)選在將 帶蓋5A的適配體5安裝于罐3的開口后振蕩罐3。由此，罐3內(nèi)的物質(zhì)得到攪拌，因溶解 液41病毒粒子溶解，核酸游離，并且包覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁珠7相當(dāng)于核 酸結(jié)合性固相載體。其后，操作者取下安裝于罐3的開口的適配體5的蓋5A，介由適配體5 將罐3安裝于筒主體9 (參照圖2A)。
[0046] 罐3優(yōu)選為可塑性且能夠膨脹的容器，例如可例示聚丙烯、聚乙烯、環(huán)烯烴聚合物 (例如，ZEONEX(注冊商標(biāo)）480R)等樹脂。柱塞10滑動而從圖2A的狀態(tài)成為圖2B的狀態(tài) 時，罐3膨脹，由此可抑制管20內(nèi)的液體的壓力過度上升，可抑制管20內(nèi)的液體被推到下 游側(cè)。優(yōu)選以罐3容易膨脹的方式在罐3形成變形部3B。
[0047] 應(yīng)予說明，提取?擴(kuò)增核酸的試樣并不局限于病毒，也可以是細(xì)胞。細(xì)胞的來源也 沒有特別限定，可以是微生物也可以是高等生物的組織切片、血液等。
[0048] 應(yīng)予說明，溶解液41是指使核酸吸附于作為核酸結(jié)合性固相載體的微粒（例如磁 性粒子M)的液體。溶解液41只要含有離液物質(zhì)就沒有特別限定，但出于破壞細(xì)胞膜或者 使細(xì)胞中含有的蛋白質(zhì)變性的目的，也可以含有表面活性劑。作為該表面活性劑，只要是 通常用于從細(xì)胞等提取核酸的表面活性劑就沒有特別限定，具體而言，可舉出Triton-X等 Triton系表面活性劑、TWeen20等Tween系表面活性劑這樣的非離子性表面活性劑，N-月 桂酰肌氨酸鈉（SDS)等陰離子性表面活性劑，特別優(yōu)選以成為0. 1~2%的范圍的方式使 用非離子性表面活性劑。并且，溶解液中優(yōu)選含有2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑。溶 解液41也可以是緩沖液，但優(yōu)選為pH6~8的中性?？紤]到這些因素，具體而言，優(yōu)選含有 3~7M的胍鹽、0~5%的非離子性表面活性劑、0~0. 2mM的EDTA、0~0. 2M的還原劑等。
[0049] 離液物質(zhì)只要在水溶液中產(chǎn)生離液離子（離子半徑大的1價陰離子），具有增加 疏水性分子的水溶性的作用，并且有助于核酸向固相載體的吸附就沒有特別限定。具體而 言，可舉出硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉、碘化鉀、高氯酸鈉等，其中，優(yōu)選蛋白質(zhì)變性作用強(qiáng)的 硫氰酸胍或鹽酸胍。這些離液物質(zhì)的使用濃度根據(jù)各物質(zhì)而異，例如使用硫氰酸胍時，優(yōu)選 以3~5. 5M的范圍使用，使用鹽酸胍時，優(yōu)選以5M以上使用。
[0050] 該溶解液41優(yōu)選含有醇或乙腈。此時，醇等的濃度沒有特別限定，下限可以為 10%以上，也可以為20%以上，也可以為30%以上，最優(yōu)選為40%以上。上限也可以為80% 以下，也可以為70%以下，也可以為60%以下，最優(yōu)選為50%以下。醇的種類沒有特別限 定，可例示甲醇、乙醇、丙醇等。通過在溶解液中添加醇等，可提高使核酸吸附于粒子等的效 果，作為核酸提取用設(shè)備使用時，能夠提高核酸的提取效率。
[0051] 另外，采集試樣的器具沒有特別限定，可以根據(jù)用途選擇刮鏟、棒、刮刀等代替棉 棒。
[0052] 罐3的內(nèi)容積沒有特別限定，例如可以為0.1 mL~100mL。罐3的材質(zhì)沒有特別 限定，例如可以是玻璃、塑料等樹脂、金屬等。特別是如果選擇透明的玻璃、樹脂作為罐的材 質(zhì)，則能夠從罐3的外部觀察內(nèi)部，因此更優(yōu)選。應(yīng)予說明，罐3與各管20可以一體成型， 也可以是能夠裝卸的。如果利用橡膠、彈性體、高分子等具有撓性的材料作為罐3的材質(zhì)， 則通過在罐3安裝有蓋的狀態(tài)下使罐3變形，能夠?qū)?的內(nèi)部加壓。由此，能夠從管的前 端側(cè)將管20的內(nèi)容物從管的內(nèi)部推向外部。
[0053] (2)筒主體
[0054] 筒主體9具有柱塞10、管20和PCR容器30。
[0055] (2-1)柱塞
[0056] 以下，參照圖2A~圖2C對柱塞10進(jìn)行說明。
[0057] 柱塞10是從作為注射筒發(fā)揮功能的管20的下游側(cè)推出液體的可動式的推桿。柱 塞10具有將管20內(nèi)的規(guī)定量的液體從管20的末端推向PCR容器30的功能。另外，柱塞 10還具有介由適配體5安裝罐3的功能。
[0058] 柱塞10具有筒狀部11和棒狀部12。筒狀部11設(shè)置于罐3側(cè)（上游側(cè)），棒狀部 12設(shè)置于管20側(cè)（下游側(cè)）。棒狀部12從筒狀部11的下游側(cè)的內(nèi)壁被板狀的2個凸緣 13支撐。棒狀部12的下游側(cè)從筒狀部11向下游側(cè)突出。
[0059] 筒狀部11在上游側(cè)和下游側(cè)開口，筒狀部11的內(nèi)壁成為液體的通路。在筒狀部 11的上游側(cè)（罐3側(cè)）的開口嵌合適配體5。在試劑盒中預(yù)先準(zhǔn)備的筒主體9的柱塞10 可以在筒狀部11的上游側(cè)的開口安裝有可拆卸的蓋。筒狀部11的下游側(cè)的開口位于管20 的上注射筒21的內(nèi)部。從筒狀部11的上游側(cè)的開口導(dǎo)入的磁珠7通過筒狀部11的內(nèi)部， 穿過凸緣13的表背而從筒狀部11的下游側(cè)的開口出來，導(dǎo)入到管20的上注射筒21。
[0060] 筒狀部11的下游側(cè)與管20的上注射筒21的內(nèi)壁嵌合。筒狀部11內(nèi)接于管20 的上注射筒21，同時相對于上注射筒21能夠在長邊方向滑動。
[0061] 在筒狀部11的上游側(cè)的開口的周圍形成有安裝適配體5的安裝臺11A。另外，安 裝臺IlA也是擠壓柱塞10時的擠壓部位。通過擠壓安裝臺11A，從而柱塞10相對于管20 滑動，從圖2A的狀態(tài)變?yōu)閳D2C的狀態(tài)。如果柱塞10向下游側(cè)移動，則安裝臺IlA接觸管 20的上緣（參照圖2C)。換言之，柱塞10的安裝臺IlA與管20的上緣的間隔成為柱塞10 的滑動長度。
[0062] 棒狀部12在初始狀態(tài)下位于管20的上注射筒21的內(nèi)部，與下注射筒22分離（參 照圖2A)。如果柱塞10相對于管20滑動，則棒狀部12插入管20的下注射筒22中，棒狀部 12內(nèi)接于下