一種枯草芽孢桿菌及其在抗太子參葉斑病中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌及其在抗太子參葉斑病中的應用，具體涉及一種拮 抗太子參葉斑病病原菌斑點葉點霉的枯草芽孢桿菌及該枯草芽孢桿菌在抗太子參葉斑病 中的應用，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 太子參為補益類常用中藥，來源于石竹科植物孩兒參 (Miq. ) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效 (中國藥典，2005)。隨著市場需求量增加，太子參種植面積和區(qū)域迅速擴大，在安徽宣州、福 建柘榮、貴州施秉形成三大主產(chǎn)區(qū)。但近年來由于耕作制度不合理等原因，太子參各產(chǎn)區(qū)病 害爆發(fā)，其中，葉斑病發(fā)病率更是高達30%-55%，導致減產(chǎn)15%-28%，嚴重影響了太子參的產(chǎn) 量和質(zhì)量，成為制約太子參發(fā)展的一個重要因素(鐘愛清，林叢發(fā)，翁琳琳，等.水楊酸 誘導太子參對葉斑病的抗性.福建農(nóng)業(yè)學報，2011，26(4): 615-619.)。
[0003] 研宄表明，太子參葉斑病是由半知菌亞門、球殼孢目、葉點霉屬真菌斑點葉點霉 侵染而引起。針對該病原菌，目前主要采用的是化學防治方法， 使用的藥劑主要有苯醚甲環(huán)唑水分散劑、氟硅唑乳油、百泰、阿米西達水分散劑、菌毒克星、 世高水分散劑、平平佳粉劑、波爾多液、多菌靈可濕性粉劑等?；瘜W藥劑起效快，但易出現(xiàn)藥 害、毒害、環(huán)境污染，且太子參中的農(nóng)藥殘留將直接危害人類健康；另一方面，化學藥劑的長 期使用易引起病原菌的抗藥性，從而降低甚至失去藥效，最終導致更嚴重的危害。因此，迫 切需要尋找新的途徑以減少化學藥劑的使用，為控制太子參葉斑病提供更有效、更安全的 治理方法。
[0004] 生物防治是利用微生物或其代謝產(chǎn)物抑制或殺死病原菌，從而達到防治太子參真 菌病害的目的。目前，關于采用生物防治法對太子參真菌病害進行控制和治理的研宄及報 道較少，經(jīng)檢索，中國專利CN104031863A和CN104164383A分別公開了一株枯草芽孢桿菌 BS-C和一株解淀粉芽孢桿菌BN-D，兩者均可高效抑制太子參根際土壤的?；图怄哏牭?菌，在防治太子參根腐病方面具有應用前景。而關于太子參葉斑病病原菌斑點葉點霉的生 物防治研宄尚未見報道。本課題組從安徽宣城太子參栽培區(qū)的太子參根際土壤中分離篩選 到一株高效拮抗太子參葉斑病病原菌斑點葉點霉的枯草芽孢桿菌 編號為JK05,直接噴施于植株及根周土壤可顯著降低太子參葉斑病的感病率和感病指數(shù)。 因此，該拮抗菌作為太子參葉斑病生防菌具有極大的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是提供一種對太子參葉斑病病原菌斑點葉點霉具有高效拮抗活性的枯草 芽孢桿菌。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供一種對太子參葉斑病病原 菌斑點葉點霉具有高效拮抗活性的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌 JK05,現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為武 漢大學，保藏號為CCTCC NO: M 2014595,保藏日期為2014年11月25日。
[0007] 本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌JK05在采用平板對峙法進行測定時，對太子參葉 斑病病原菌斑點葉點霉的抑制率達到80. 33%。
[0008] 本發(fā)明的另一目的提供上述枯草芽孢桿菌在抗太子參葉斑病中的應用。
[0009] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：將枯草芽孢桿菌JK05進行液 體發(fā)酵制備成菌液，直接噴施于太子參植株及根周土壤，其施用濃度為IO 6-IO8 cfu / mL， 施用量為20-100 mL /株，施用菌液后進行正常的田間管理。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌JK05菌液按如下方法制備得到：將冰箱保存的枯草芽孢桿菌 JK05斜面轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基進行活化（27-37 °C );將活化后的菌株JK05接種至LB液 體培養(yǎng)基，27-37 °C、110-130 r / min條件下培養(yǎng)12-24 h獲得種子液；將種子液接種至 LB液體培養(yǎng)基(接種量為1-5%)，于27-37 °C、110-130 r / min條件下培養(yǎng)48-96 h獲得 JK05菌液，其中JK05芽孢數(shù)達到IO9 cfu / mL以上，用于太子參植株及根周土壤的噴施。
[0011] 所述LB液體培養(yǎng)基包括以下組分：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L， pH7. 0-7. 4。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是： (1)未施用枯草芽孢桿菌JK05的對照處理在接種葉斑病病原菌斑點葉點霉30 d后，感 病率超過90%，感病指數(shù)為90以上；而施用JK05的處理組在接種病原菌30 d后，感病率僅 大約40%，感病指數(shù)也低于40?？梢?，枯草芽孢桿菌JK05對降低太子參葉斑病的發(fā)病率及 感病指數(shù)效果顯著，對于減少化學農(nóng)藥在太子參栽培管理過程中的使用有積極作用。
[0013] (2)枯草芽孢桿菌JK05培養(yǎng)條件簡單，培養(yǎng)周期短，易于工業(yè)化生產(chǎn)及保存，具有 良好的開發(fā)應用前景。
[0014] 說明書附圖 圖1為枯草芽孢桿菌JK05的抑菌效果試驗結(jié)果圖；圖中a、接 JK05 ;b、對照； 圖2-4為枯草芽孢桿菌JK05抗太子參葉斑病的作用效果圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于 此。
[0016] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水 1000 ml，pH 7. 0-7. 4,121 °C，0.1 MPa，高壓滅菌 20 min。
[0017] PDA培養(yǎng)基的配制：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水定容至1000 ml，pH 自然，121 °C，0.1 MPa 高壓滅菌 20 min。
[0018] LB固體培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g， pH 7.0-7. 4,121 °C，0.1 MPa，高壓滅菌 20 min。
[0019] LB液體培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0-7.4， 121 °C，0.1 MPa，高壓滅菌 20 min。
[0020] 實施例1 (1)根際細菌的分離純化 土樣為應用"五點采樣法"采集自安徽宣城太子參栽培區(qū)的太子參根際土，按照土壤微 生物常規(guī)平板稀釋法進行分離。稱取根際土樣品10 g左右，放入裝有玻璃珠的100 mL無 菌水中振蕩30 min，使其中的土壤顆粒分散均勻，靜置5 min后，取土壤懸液的上清液部分 進行10倍梯度稀釋，依次稀釋至10'10'10'10'KT6和10'將其中10'KT 6和KT7的 稀釋液各取0.1 mL涂布至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，所有平板置于恒溫培養(yǎng)箱中27 °C培 養(yǎng)2-3 d，待平板表面長出菌落后，對菌落進行多次劃線分離，通過菌落形態(tài)觀察結(jié)合鏡檢 結(jié)果獲得純菌株，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] (2)拮抗菌JK05的篩選 按上述方法分離得到的根際細菌進一步采用平板拮抗試驗進行拮抗菌的篩選。將太子 參葉斑病病原菌斑點葉點霉接種到PDA平板的中央，27 °C培養(yǎng)7 d至形成菌落，用滅菌后 的打孔器在菌落上打孔，獲得直徑5 mm的菌餅。將斑點葉點霉菌餅接種至另一 PDA平板中 央，再將分離得到的根際細菌分別呈十字方向點植到菌餅周圍，控制與菌餅中心的距離為3 cm，同時以僅接種有斑點葉點霉菌餅而未點植根際細菌的平板作為對照，所有平板于27 °C 培養(yǎng)7 d后觀察有無抑菌帶。
[0022] 將出現(xiàn)抑菌帶的根際細菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接10次，將每一代培養(yǎng)物 進行平板拮抗試驗，觀察其拮抗活性的穩(wěn)定性。最終從中獲得一株拮抗活性高且穩(wěn)定的細 菌菌株，編號為JK05,于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0023] (3)拮抗菌JK05的鑒定 提取拮抗菌JK05的基因組DNA，利用通用引物對16srDNA進行擴增及測序，獲得 1459bp的擴增片段。
[0024] 測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性序列比對分析，結(jié)果顯示拮抗菌JK05與 枯草芽孢桿菌相關基因片段在序列上具有100%相似值，因此，將拮 抗菌JK05鑒定為枯草芽孢桿菌
[0025] (4)拮抗菌JK05抑菌活性測定 抑菌活性測定(平板對峙法）：在PDA平板中心接入直徑5 mm的斑點葉點霉菌餅，挑取 拮抗菌JK05在PDA平板兩側(cè)沿一直線對稱劃線接種，與平板中央菌餅相距3 cm，置于27 °C 培養(yǎng)10 d，觀察斑點葉點霉菌落生長情況，并測量其菌落直徑，以不接拮抗菌的平板作為對 照，抑菌率通過下式進行計算：
經(jīng)測定，拮抗菌JK05對斑點葉點霉10天抑菌率達80. 32%，試驗結(jié)果見圖1。
[0026] 實施例2 斑點葉點霉孢子懸液的制備：將冰箱保存的斑點葉點霉斜面接種至PDA培養(yǎng)基進行活 化（27 °C);將活化后