一種粘質(zhì)沙雷氏菌及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更具體的涉及一種促生兼具生物修復(fù)土壤的粘質(zhì)沙雷氏 菌及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是指自由生活 在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長及其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制 有害生物的有益菌類。當(dāng)病害發(fā)生時施用PGPR微生物可以干擾植物與病原的互作，形成有 益于植物的新的平衡。
[0003] PGPR微生物防病促生機制是多種方式綜合作用下的結(jié)果，包括PGPR微生物轉(zhuǎn)化 土壤中植物不能直接利用的養(yǎng)分、產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的植物激素、產(chǎn)生揮發(fā)性氣體、產(chǎn)生抑 制病原菌侵染的抑菌物質(zhì)以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等。目前許多PGPR菌株已被廣泛應(yīng)用 并成功商業(yè)化。
[0004] 另外，目前，在我國各地區(qū)的土壤中有不同程度的鉛污染現(xiàn)象。土壤、水和肥料中 重金屬鉛可被植物吸收，然后通過農(nóng)產(chǎn)品進入人體，從而危害人體健康。
[0005] 針對土壤重金屬污染，植物-微生物修復(fù)技術(shù)由于效果顯著、消耗小、無二次污染 等優(yōu)點受到廣大科研工作者的青睞。研宄表明，微生物，尤其是植物根際微生物與植物相互 作用，可以有效地提高土壤修復(fù)效果。篩選可以富集重金屬鉛的微生物，在防治植物病害、 促進植物生長的同時，為污染土壤的修復(fù)提供微生物資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明人進行了銳意研宄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從土壤中分離獲得菌株 Sa，通過觀察菌株Sa的形態(tài)學(xué)特征，分析其生理生化特性以及同時結(jié)合16Sr DNA序列同源 性分析鑒定該菌株Sa為粘質(zhì)沙雷氏菌，同時研宄了菌株Sa在防病、促生、定殖及對Pb2+的 吸附方面的作用，從而完成本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種促生兼具生物修復(fù)土壤的粘質(zhì)沙雷氏菌，其中，該 粘質(zhì)沙雷氏菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 10711。
[0008] 本發(fā)明所提供的從土壤中分離出來的菌株Sa經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征分 析以及16s rDNA序列同源性分析被鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)，該菌株 Sa已于2015年4月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱 CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC NO. 10711。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種植物枯萎病的防治劑，其中，包含保藏編號為 CGMCC NO. 10711的粘質(zhì)沙雷氏菌。作為萌蘆科植物的實例，具體可舉出萌蘆、瓢瓜、黃瓜、冬 瓜，南瓜、絲瓜、西瓜以及甜瓜中的一種多種。
[0010] 特別的，作為黃瓜，可舉出品種為津綠11號的黃瓜。
[0011] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種植物生長促進劑，其中，包含保藏編號為CGMCC NO. 10711的粘質(zhì)沙雷氏囷。
[0012] 作為萌蘆科植物的實例，具體可舉出萌蘆、瓢瓜、黃瓜、冬瓜，南瓜、絲瓜、西瓜以及 甜瓜一種或多種。
[0013] 特別的，作為黃瓜，可舉出品種為津綠11號的黃瓜。
[0014] 本發(fā)明的在一目的在于提供一種土壤修復(fù)劑，其中，包含保藏編號為CGMCC NO. 10711的粘質(zhì)沙雷氏囷。
[0015] 由本發(fā)明提供的粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa能夠吸附重金屬，特別的，粘質(zhì)沙雷氏菌菌 株Sa能夠?qū)ν寥乐械亩r鉛離子進行吸附、沉淀、氧化和還原，從而有效的降低土壤中鉛 的毒性。經(jīng)本發(fā)明人研宄發(fā)現(xiàn)，粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa能夠加快植物對土壤中重金屬污染物 的富集作用，從而獲得更好的效果。
[0016] 本發(fā)明提供的一種保藏號為CGMCC NO. 10711的粘質(zhì)沙雷氏菌，對黃瓜枯萎病有良 好的防治效果，防治效果可高達57.3% ;還能夠在黃瓜幼苗內(nèi)定殖并對幼苗有顯著的促生 作用；此外，通過原子吸收儀測定培養(yǎng)基中Pb2+的濃度變化，可以得知該粘質(zhì)沙雷氏菌可 以吸附培養(yǎng)基中的Pb 2+，吸附效果好，吸附率可達47. 63%。
[0017] 保藏說明
[0018] 囷種名稱：粘質(zhì)沙雷氏囷
[0019] 拉丁名：（Serratia marcescens)
[0020] 菌株編號：Sa
[0021] 保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0022] 保藏機構(gòu)簡稱：CGMCC
[0023] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0024] 保藏日期：2015. 4. 10
[0025] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC NO. 10711。
【附圖說明】
[0026] 圖1為實施1中通過MEG5. 0軟件構(gòu)建獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，本發(fā)明的特點和優(yōu)點將隨著這些說明而 變得更為清楚、明確。
[0028] 在下述實施例中：
[0029] 黃瓜品種為"津綠11號"，由天津市綠豐園藝心技術(shù)開發(fā)有限公司提供；黃瓜枯 萎病菌（Fusarium oxysporum)，由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室提供；DNA分子標(biāo)記（DNA Marker)以及PCR擴增試劑，由寶生物工程（大連）有限公司提供；細(xì)菌基因組DNA提取試 劑盒，由北京索萊寶科技有限公司（Solarbio)提供；Bio-Tek膠回收試劑盒，由美國Omega 生物技術(shù)有限公司提供；細(xì)菌通用引物，由上海生工生物工程有限公司提供；PCR儀，由美 國Bio-Rad公司提供；電泳儀，由日本Mupid公司提供；凝膠成像系統(tǒng)，由英國UVItec公司 提供；原子吸收分光光度計（AA-6300C)，由島津（Shimadzu)公司提供；培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g/L，葡萄糖 20g/L。
[0030] 實施例一粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的分離以及鑒定
[0031] 1、粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的分離
[0032] 通過包括下述步驟的方法從天津市西青區(qū)黃瓜根際土壤中分離獲得：
[0033] (1)取IOg黃瓜根際土壤先加入到90mL無菌水中，然后接著加無菌水進行稀釋，分 別形成無菌水的稀釋度為1 : 1〇2、1 : 1〇3、1 : 1〇4、1 : 1〇5、1 : IO6的土壤稀釋液，最后 進行充分振蕩；
[0034] (2)吸取步驟（1)中稀釋度為 I : 102、1 : 103、1 : 104、1 : 105、1 : IO6的土壤 稀釋液各100 μ L相應(yīng)的涂布于分別含有400、600、800、1000、1200、1400mg/l的硝酸鉛的LB 固體培養(yǎng)基中，然后置于28°C下培養(yǎng)Id ;
[0035] (3)挑取經(jīng)Id培養(yǎng)后長出的單菌落，然后在LB培養(yǎng)基平板上純培養(yǎng)，獲得菌株 S& 〇
[0036] 2、粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的形態(tài)學(xué)鑒定
[0037] 對上述步驟1中處于對數(shù)生長期的菌株Sa采用革蘭氏染色法進行染色，然后通過 光學(xué)顯微鏡觀察粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的形態(tài)學(xué)特征。
[0038] 通過觀察，菌株Sa的單菌落為圓形，菌落中央凸起，紅色，不透明，濕潤，邊緣整 齊。另外，菌株Sa的細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢。
[0039] 3、粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的生理生化特征分析
[0040] 參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（第九版），同時參照《微生物學(xué)實驗》（沈萍，范秀 容，李廣武.微生物學(xué)實驗（第四版）.北京：高等教育出版社，2007.)對菌株Sa的生理生 化特性進行測定，結(jié)果如下表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 注：在上述表1中，" + "表示陽性，""表示陰性。
[0044] 4、粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Sa的16s rDNA序列同源性分析
[0045] 菌株Sa的PCR擴增：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取步驟1中分離得 到的菌株Sa的16s rDNA作為PCR擴增模板后，利用PCR儀并以細(xì)菌通用引物27F 5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1527R5，-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3，進行 16s rDNA 的 擴增。
[0046] 在上述擴增過程中，擴增體系為100 μ L !IOXBufTerlO μ L，脫氧核糖核苷三磷 酸（dNTP)4yL，細(xì)菌通用引物（primer)27F 4yL，細(xì)菌通用引物（primer) 1527R 4yL， TaqDNA聚合酶1 μ L，擴增模版DNA 1 μ L，加滅菌去離子水補至100 μ L ;PCR擴增程序為： 94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性40s，50°C復(fù)性40s，72°C延伸45s循環(huán)35次，最后72°C充 分延伸10min，4°C保存。
[0047] PCR擴增產(chǎn)物的純化：取5 μ LPCR擴增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳測試。
[0048] 目的片段測序：在電泳儀上進行電泳測試后，用Bio-Tek膠回收試劑盒回收 目的片段后由北京華大基因進行測序，將測定的序列提交至GenBank，獲得序列號為： KM596774,再通過BlAST進行序列同源性檢索分析。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān) 菌株的16S rDNA進行比較后，使用MEGA5.0軟件來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定出菌株Sa的 分類學(xué)地位。
[0049] 根據(jù)圖1所示的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株Sa與GenBank登錄號為M59160和KF155286的粘 質(zhì)沙雷氏菌株（Serratia marcescens)同源性高達100%。
[0050] 注：GenBank是美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫，從公共資源中獲取序列數(shù)據(jù)，
[0051] MEGA5. 0為專用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的軟件，
[0052] BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù) 庫中進行相似性比較的分析工具，
[0053] 一般以同源性彡99%作為種水平的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
[0054] 鑒于上述對菌株Sa的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分 析結(jié)果，將步驟1中分離得到的細(xì)菌Sa鑒定