菌液atp含量和od比值在發(fā)酵和發(fā)酵劑制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌株發(fā)酵培養(yǎng)領域，具體地，涉及一種在培養(yǎng)過程中通過測定菌液ATP 含量和OD值的比值以判斷發(fā)酵終點的方法，以及該方法在菌株保存，特別是在制備乳酸菌 發(fā)酵劑中的應用，本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵劑的制備方法，以及由該方法制備的發(fā)酵劑。
【背景技術】
[0002] 在乳酸菌飲料或是干酪或是其他發(fā)酵制品生產的過程中，高品質的直投式發(fā)酵劑 是保證產品質量的前提。直投式發(fā)酵劑制備的過程主要包括了菌體的高密度發(fā)酵及發(fā)酵劑 的冷凍制備兩個部分。而這個過程中的諸多因素都會對終產品發(fā)酵劑的性能造成影響，比 如，發(fā)酵的條件、發(fā)酵收獲時間，冷凍操作過程等。
[0003] 發(fā)酵劑對于菌體的要求首先是具有高活性。其次是要有較高的耐受性，而并不僅 僅局限于對菌數(shù)的要求。在現(xiàn)有的發(fā)酵劑的生產過程中一般都是通過監(jiān)控發(fā)酵過程中的pH 值，0D600值等數(shù)據(jù)指標，以判斷最適宜的菌種收獲時間。但通過常規(guī)的判斷方法所制備的 發(fā)酵劑不能夠得到菌體最理想的狀態(tài)，并且發(fā)酵劑的制備時間較長。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服以上缺陷，一方面，提供了一種菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該 方法包括：將菌株接種到培養(yǎng)液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，測定菌液的 ATP含量和OD值的比值，并使其達到頂點，以結束發(fā)酵培養(yǎng)。
[0005] 第二方面，本發(fā)明還提供了如上所述的方法在菌株保存中的應用。
[0006] 第三方面，本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照如上 所述的方法對用于制備發(fā)酵劑的菌株進行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液。
[0007] 第四方面，本發(fā)明還提供了由以上方法制備的發(fā)酵劑。
[0008] 通過上述技術方案，在發(fā)酵培養(yǎng)的過程，測定菌液的ATP含量和OD值的比值，以該 比值達到頂點時作為發(fā)酵培養(yǎng)的終點以結束發(fā)酵過程。采用該方法培養(yǎng)得到的菌體具有較 高的活性和耐受性，且該時間點要早于通過單純測定0D600值或是監(jiān)測活菌數(shù)判斷得到的 收獲時間點，因此，具有更短的發(fā)酵時間，并且，將這樣的菌體保存后再次用于發(fā)酵時能夠 表現(xiàn)出優(yōu)越的發(fā)酵性能。
[0009] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0010] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中菌液ATP含量 隨發(fā)酵時間的變化曲線。
[0012] 圖2是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中菌液pH值和 OD值隨發(fā)酵時間的變化曲線。
[0013] 圖3是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的菌液ATP/0D 值隨發(fā)酵時間的變化曲線。
【具體實施方式】
[0014] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人在研宄的過程中發(fā)現(xiàn)，ATP普遍存在于所有活的生物體中，被用來 貯存和傳遞化學能，在微生物菌體中也不例外，微生物死亡后，在細胞內酶的作用下，其體 內的ATP會被很快的降解掉；而對于一定生理時期內的活體微生物，其體內的ATP會保持在 一個較為恒定的水平。而ATP作為一種能量的載體，同時也反應了菌體內能量代謝水平的 情況，菌體內含有的ATP含量越高，代表了菌體處于一個更活躍的能量代謝狀態(tài)。而對于乳 酸菌來說，其產生ATP的途徑主要是通過葡萄糖或乳糖向乳酸轉化的過程實現(xiàn)的，ATP含量 越高，代表了葡萄糖向乳酸轉化效率越高，表征了此時菌體具有更高的發(fā)酵活性。
[0016] 基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人試圖通過在菌體培養(yǎng)的過程中，通過測定菌體體 內ATP的含量，當其達到最高點時，結束發(fā)酵以進行乳酸菌發(fā)酵劑的制備，而不是通過常規(guī) 的通過測定OD值或是pH的方法，當培養(yǎng)進行對數(shù)末期時結束發(fā)酵，以進行乳酸菌發(fā)酵劑的 制備。但通過這樣的方法制備得到的發(fā)酵劑性能的改善程度并沒有達到預期的效果，并且 制備時間較長。
[0017] 本發(fā)明的發(fā)明人又發(fā)現(xiàn)，通過在發(fā)酵過程中，分別測定菌體體內ATP的含量以及 OD值，并計算兩者的比值，也即，得到單位菌體密度的ATP含量，通過以該比值達到頂點為 基準，來判斷發(fā)酵終點。這樣基本上保證了每個菌體細胞內的ATP含量均處于一個最佳的 水平。以該方法制備得到的發(fā)酵劑的性能能夠得到提高。例如，通過如上方法判斷發(fā)酵培 養(yǎng)的終點，能夠使菌體達到最大的活性，并且得到的菌體對環(huán)境也具有較高的耐受性，將這 樣的菌體保存后再次用于發(fā)酵時能夠表現(xiàn)出優(yōu)越的發(fā)酵性能。并且采用該方法能夠提早結 束發(fā)酵過程，使得發(fā)酵時間縮短，帶來了較高的社會效益。
[0018] 基于以上發(fā)現(xiàn)，一方面，本發(fā)明提供了一種菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該方法包括：將 菌株接種到培養(yǎng)液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，測定菌液的ATP含量和OD 值的比值，并使其達到頂點，以結束發(fā)酵培養(yǎng)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，術語"頂點"并非是嚴格意義上指代的一個特定的具體點值，其根據(jù) 培養(yǎng)菌株的不同，培養(yǎng)條件的不同以及對所述頂點要求程度的不同而會在一定的范圍內有 所差別。所述頂點即可以理解為菌液中ATP的含量和OD值的比值的頂點值，也可以理解為 當菌液中ATP的含量和OD值的比值達到頂點值時所對應的時間。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，確定菌液的ATP含量和OD值比值達到頂點的方法沒有特別的限制， 本領域技術人員可以采用常規(guī)的方法進行確定。例如，可以在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中較粗略的 獲得該頂點：具體的，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，通過間隔取樣或是在線時時監(jiān)控的方法， 測定培養(yǎng)液中ATP的含量以及OD值，計算得出培養(yǎng)液中ATP的含量和OD值的比值，待觀察 到的比值剛有所下降時立即結束發(fā)酵培養(yǎng)，該時間點便為所述頂點。其中，當通過間隔取樣 的方法確定所述頂點時，當所述比值在上升緩慢階段時，可以適當?shù)目s短取樣的間隔。還 例如，可以通過提前繪制曲線的方法精確獲得所述頂點，具體的，將同一菌株進行預發(fā)酵培 養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件與正常培養(yǎng)時完全相同，在培養(yǎng)的過程中通過間隔取樣或 是在線時時監(jiān)控的方法，測定培養(yǎng)液中ATP的含量以及OD值，計算得出培養(yǎng)液中ATP的含 量和OD值的比值，然后以培養(yǎng)時間為橫坐標，ATP的含量和OD值的比值為縱坐標繪制發(fā)酵 曲線，從而得到所述頂點。
[0021] 其中，所述ATP的含量和OD值的測定方法可以為本領域常規(guī)的測定方法，例如，可 以使用微生物細胞活力分析儀（Microbial Cell Viability Assay)并按照其說明書進行 ATP含量的測定，可以通過常規(guī)的分光光度計或是酶標儀進行OD值的測定。
[0022] 其中，微生物細胞活力分析儀是通過如下的原理進行檢測的：
[0023] ATP生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶E和Mg2+的作用下，熒光素 LH與ATP發(fā)生 腺苷?；换罨罨蟮臒晒馑嘏c熒光素酶相結合，形成了熒光素一AMP復合體，并放出 焦磷酸。該復合體被分子氧所氧化，形成激發(fā)態(tài)復合物Ρ*-Ε · AMP，放出CO2，當該復合物從 激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光，從而被儀器檢測到。
[0024] 本發(fā)明對待培養(yǎng)的菌株沒有特別的限制，由于采用本發(fā)明的方法可以獲得活性和 耐受性較高的培養(yǎng)菌株，并且在后期使用時，所述獲得的培養(yǎng)菌株能夠較快的進入狀態(tài)并 積極發(fā)揮活性。因此，本發(fā)明的方法特別適用于需要進行保存的任何菌株的培養(yǎng)，待培養(yǎng)結 束后，可以進行常規(guī)的保存，例如，甘油管的保存，制備成凍干粉的保存等等。
[0025] 在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述菌株為乳酸菌菌株，優(yōu)選的，所述乳酸 菌菌種包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根 據(jù)本發(fā)明一種具體的實施方式，所述乳酸菌為保藏號CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0026] 因此，第二方面，本發(fā)明提供了如上所述的方法在菌株保存中的應用。
[0027] 所述菌株可以為任何需要保存的菌株。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實施方式中，所 述菌株為乳酸菌菌株，優(yōu)選的，所述乳酸菌菌株包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧 桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明一種具體的實施方式，所述乳酸菌為保藏 號CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0028] 另外，第三方面，本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照 如上所述的方法對用于制備發(fā)酵劑的菌株進行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液。
[0029] 根據(jù)