一種交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程、生物催化領(lǐng)域，具體涉及交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]SDS (十二烷基磺酸鈉)等表面活性劑作為能改變水和其它液體表面張力或兩相間界面張力的物質(zhì)，具有潤(rùn)濕、分散、乳化、增溶、起泡、洗滌、防腐和殺菌等作用，是一系列家用和工業(yè)用洗滌劑中的主要成分。由于SDS等表面活性劑隨著工業(yè)廢水和生活污水大量排放到各種水體中，其已造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。它們會(huì)形成泡沫覆蓋水面，消耗水體中的溶解氧，使水質(zhì)惡化，對(duì)水生生物的生存和繁殖及環(huán)境造成一定的污染和危害。研宄證明低濃度的SDS便可抑制生物體中一些關(guān)鍵酶的活性，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，造成疾病。此外，SDS還對(duì)其它有害物質(zhì)形成增溶、乳化和分散作用，富集有機(jī)污染物，抑制微生物對(duì)有機(jī)物的降解，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的危害等。因此SDS等表明活性劑污染的治理已成為環(huán)境保護(hù)工程中重要的環(huán)節(jié)。
[0003]傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法處理污水，成本高，對(duì)污染物的去除不夠理想，還會(huì)引入二次污染。相比而言，生物酶技術(shù)處理污水效率高、成本低，環(huán)保，并且還可循環(huán)使用。烷基硫酸酯酶是硫酸酯酶的一種，能夠水解硫酸酯鍵并釋放無機(jī)硫酸根和相應(yīng)的醇類，可有效降解表面活性劑，降低其對(duì)環(huán)境的污染。例如，Long等從嗜熱菌Pseudomonas sp.S9中分離獲得一種嗜熱型烷基硫酸酯酶sdsAP(專利號(hào)CN101942427B，也被稱為sdsA)，該酶對(duì)SDS有較高的降解活性，并且可以在原核中大量表達(dá)，為通過基因工程獲得SDS降解酶來治理SDS污染奠定了基礎(chǔ)。
[0004]但作為降解菌或生物酶本身，其穩(wěn)定性和降解污染物的效率均受到如水體pH值、溫度及水中含有的其它物質(zhì)等諸多因素的影響，且不能回收重復(fù)利用，大大限制了它們的應(yīng)用和推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服游離烷基硫酸酯酶在復(fù)雜環(huán)境中的不穩(wěn)定性、活性低及不能重復(fù)利用等問題，通過將烷基硫酸酯酶制備成交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)烷基硫酸酯酶的高效固定，從而能夠在SDS等表面活性劑的污染治理中得以有效地應(yīng)用。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明提供了一種交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)在濃度為10-50mg/ml的烷基硫酸酯酶溶液中，加入終濃度為100-300mg/ml的聚乙二醇，進(jìn)行沉淀分離；
[0008](2)進(jìn)一步加入終濃度為5_15mM的戊二醛，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；和
[0009](3)離心、棄上清，并洗滌至無可溶性蛋白，即得交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體。
[0010]在本發(fā)明中，燒基硫酸醋酶優(yōu)選來源于嗜熱菌Pseudomonas sp.S9的嗜熱型燒基硫酸醋酶sdsAP(也被稱為sdsA)。
[0011]本發(fā)明所使用的烷基硫酸酯酶可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備得到。例如sdsAP可以通過如下方法制備得到:
[0012]將去掉信號(hào)肽的sdsAP cDNA克隆到原核表達(dá)載體pET-His載體上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)。于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6時(shí)，加入終濃度3mM的IPTG 16°C誘導(dǎo)14h。離心收集菌體，加入裂解buffer (50mM pH8.0Tris_HCl，含10mM NaCl)進(jìn)行超聲破碎，離心并收集上清，再進(jìn)行鎳離子親和層析純化，并用低濃度例如20mM咪唑洗脫雜蛋白，最后用高濃度例如500mM咪唑洗脫獲得純化的sdsAP蛋白。
[0013]在本發(fā)明中，聚乙二醇選自聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及其混合物。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選燒基硫酸醋酶的濃度為20-40mg/ml，最優(yōu)選約20mg/ml。優(yōu)選聚乙二醇的終濃度為150-200mg/ml，最優(yōu)選約170mg/ml。優(yōu)選戊二醛的終濃度為8_12mM，最優(yōu)選約10mM。
[0015]在本發(fā)明中，烷基硫酸酯酶溶液的pH值優(yōu)選為7.0-9.0，更優(yōu)選為7.5-8.5，最優(yōu)選約8.0，溶劑可以使用本領(lǐng)域常用的緩沖液，例如但不限于Tris-HCl緩沖液和PBS緩沖液等。緩沖液中優(yōu)選加入能夠維持蛋白穩(wěn)定的試劑，包括但不限于NaCl和/或甘油等，其中，NaCl的濃度優(yōu)選為100-500mM，甘油的濃度優(yōu)選為50-100mg/ml。洗滌用裂解緩沖液，優(yōu)選用含有約50-150mM的NaCl，約20_100mM的pH約7.0-9.0的Tris-HCl裂解緩沖液，更優(yōu)選用含有約10mM NaCl的約50mM的pH約8.0的Tris-HCl裂解緩沖液。
[0016]本發(fā)明的制備方法優(yōu)選在4_16°C下進(jìn)行操作。沉淀分離的時(shí)間優(yōu)選為10-60min，更優(yōu)選20-40min，最優(yōu)選約30min。交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為l_4h，更優(yōu)選1.5_3h，最優(yōu)選約2h。離心轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間要能充分沉淀交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體，例如離心轉(zhuǎn)數(shù)優(yōu)選為4000-18000rpm,更優(yōu)選8000-14000rpm，最優(yōu)選12000rpm ;離心時(shí)間優(yōu)選為5_30min，更優(yōu)選10-15min，最優(yōu)選約lOmin。沉淀和交聯(lián)優(yōu)選在pH為7.0-9.0，更優(yōu)選在pH為7.5-8.5，最優(yōu)選在PH約為8.0的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體可進(jìn)一步干燥成粉末保存。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備得到的交聯(lián)烷基硫酸酯酶聚集體。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:設(shè)備簡(jiǎn)易，操作簡(jiǎn)單，成本低廉；沉淀過程中的沉淀效率和酶活保留率高，均達(dá)93%以上，交聯(lián)效率幾乎為100% ;固定化烷基硫酸酯酶的酶活回收率高，大于81% ;溫度和pH適用性都明顯提高，不僅最適溫度提高了 10°C，且溫度在10-100°C、pH為4-10的范圍內(nèi)都能適用；同時(shí)很好的保留了酶對(duì)底物的親合力，且可回收重復(fù)使用；極大地提高了烷基硫酸酯酶的穩(wěn)定性，耐儲(chǔ)存。
【附圖說明】
[0019]圖1經(jīng)鎳離子親和層析純化的sdsAP的SDS-PAGE檢測(cè):1，Marker ;2和3，經(jīng)鎳離子親和層析純化的sdsAP蛋白。
[0020]圖2 SDS溶液滴定Stain-all染色液標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]圖3 sdsAP-CLAs在不同溫度條件下的活性分析。
[0022]圖4 sdsAP-CLAs在不同pH條件下的活性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0024]實(shí)施例1烷基硫酸酯酶sdsAP的制備和活性測(cè)定
[0025](I)烷基硫酸酯酶sdsAP的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0026]將去掉信號(hào)肽的sdsAP cDNA(氨基酸42_674)克隆到原核表達(dá)載體pET_His載體上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)。于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_約為0.6時(shí)，加入終濃度3mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16°C誘導(dǎo)14h。離心收集菌體，加入裂解buffer (50mM pH8.0Tris-HCl，含10mM NaCl)進(jìn)行超聲破碎，離心并收集上清，進(jìn)行鎳離子親和層析純化，并用20mM咪唑洗脫雜蛋白，最后用500mM咪唑洗脫獲得純化的sdsAP烷基硫酸酯酶，參見圖1。
[0027](2)烷基硫酸酯酶sdsAP的活性測(cè)定
[0028]配置Stain-all儲(chǔ)存液:溶解Img Stain-all粉末于Iml異丙醇與水的混合溶液中(體積比1:1)，避光4°C保存(可保存I個(gè)月)。
[0029]配制Stains-all工作液:將Iml Stain-all儲(chǔ)存液與Iml甲酰胺混合后加入到18ml去離子水中(室溫避光可以放置3天)。
[0030]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:用25mM的Tris-HCl buffer (pH 8.0)配制成lg/L的SDS溶液。取I μ I SDS溶液加入到980 μ I Stains-all工作液中，并用水補(bǔ)充至1ml，用移液槍混勻，在UV 438nm處測(cè)定吸光值，每次增加I μ I SDS溶液，并記錄吸光值一次，最后做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算公式，參見圖2。
[0031]活性測(cè)定:配置I % 的 SDS 溶液，440 μ I 裂解 buffer+50 μ I 0.1 % SDS+10 μ I
0.15mg/ml sdsAP 酶，70°C反應(yīng) 5min，取 20 μ I 反應(yīng)液加入到 980 μ I Stains-all 工作液中，在UV 438nm處測(cè)定吸光值，并設(shè)對(duì)照，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算sdsAP酶的酶活，為20 μηιο?.mirT1.mg'酶活單位定義為每分鐘降解I μπιο? SDS所需要的酶量。
[0032]實(shí)施例2交聯(lián)烷基硫酸酯酶sdsAP聚集體(sdsAP-CLAs)的制備和活性測(cè)定
[0033]取200 μ I濃度分別為20mg/ml，30mg/ml和40mg/ml的sdsAP酶溶液置于6個(gè)
1.5ml的eppedorf管中，其中，溶劑為pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，其中含有濃度為300mM的NaCl和濃度為50mg/ml的甘油。每個(gè)濃度兩組，一組中分別加入終濃度為150mg/ml、170mg/ml 和 200mg/ml 的 PEG4000，另一組中分別加入終濃度為 150mg/ml、170mg/ml 和200mg/ml的PEG6000，均于4°C沉淀分離30min，期間每隔幾分鐘顛倒一次。
[0034]每管取一半反應(yīng)液，離心后取上清按照實(shí)施例1中相同的方法檢測(cè)酶活，并在去掉上清的沉淀中加入含有10mM NaCl的50mM pH8.0 Tris-HCl裂解緩沖液再溶解沉淀，并按照實(shí)施例1中相同的方法檢測(cè)酶活。分別計(jì)算沉淀效率和酶活保留率，其中:沉淀后總酶活與沉淀前總酶活的比值為沉淀效率，沉淀再溶解后總酶活與沉淀后總酶活的比值為酶活保留率，其中，沉淀后總酶活為沉淀前總酶活性減去上清殘留總酶活。結(jié)果表明，分別加入終濃度為15%、17%和20%的PEG4000組的沉淀效率分別為97.1%、97.5和98.0%，酶活保留率分別為95.0 %、96.5 %和98.5 %;分別加入終濃度為15 %、17 %和20 %的PEG6000組的沉淀效率分別為97.5%,98.2%和98.5%，酶活保留率分別為96.0%,96.5%和99.0%。由此可見，各組沉淀效率均在97%以上，活性保留率均在95%以