nual(3rd ed·)，Volume 2,Chapter 8,pp.8.1-8.126, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sping Harbor, 2001〇
[0036] 發(fā)明效果
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在短時間并且以高分離性能進行核酸的PCR擴增產(chǎn) 物、該PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶片段、核酸的限制性內(nèi)切酶片段等目標核酸的分離檢 測的離子交換色譜法用洗脫液。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠通過使用上述離子交換色 譜法用洗脫液的離子交換色譜法在短時間精度良好地分析目標核酸的核酸鏈的分析方法。
【附圖說明】
[0038] 圖1是使用實施例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱1得到的色譜圖。
[0039] 圖2是使用實施例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖。
[0040] 圖3是使用實施例2的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖。
[0041] 圖4是使用比較例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱1得到的色譜圖。
[0042] 圖5是使用比較例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖。
[0043] 圖6是使用比較例2的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱1得到的色譜圖。
[0044] 圖7是使用比較例2的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖。
[0045] 圖8是使用比較例3的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖。
【具體實施方式】
[0046] 以下，列舉實施例，對本發(fā)明更詳細地進行說明，但本發(fā)明不僅限定于這些實施 例。
[0047] (實施例1、2以及比較例1~3)
[0048] 在25mmol/L Tris鹽酸緩沖液中添加表1所示的鹽，使其濃度達到1000mmol/L，制 備實施例1、2以及比較例1~3的離子交換色譜法用洗脫液。所得到的洗脫液的pH全部 為 7. 5。
[0049] 〈評價〉
[0050](分離性能的確認）
[0051] 使用以下的方法，使用實施例以及比較例中制備的離子交換色譜法用洗脫液，將 分離檢測目標核酸時的分離性能進行比較。
[0052] (陰離子交換色譜柱的準備）
[0053] (陰離子交換色譜柱1)
[0054] 作為市售的色譜柱，準備以下的色譜柱（陰離子交換色譜柱1)。
[0055] 品名：TSK-gel DNA-STAT (東曹株式會社制）
[0056] 色譜柱尺寸：內(nèi)徑4. 6mmX長度IOOmm
[0057] 離子交換基團：季銨基
[0058] (陰離子交換色譜柱2)
[0059] 在帶攪拌機的反應器中，在3重量％聚乙烯醇（日本合成化學公司制）水溶液中 添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯（新中村化學工業(yè)公司制）300g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯 (新中村化學工業(yè)公司制）100g以及過氧化苯甲酰（?シ夂化學公司制）1.0 g的混合物。攪 拌的同時進行加熱，在氮氣氣氛下，80°C下聚合1小時。接著，作為具有強陽離子性的離子 交換基團（季銨基）的單體，將甲基丙烯酸乙基三甲基氯化銨（和光純藥工業(yè)公司制UOOg 在離子交換水中溶解，再將所得到的溶液添加到上述反應器中。接著，攪拌的同時，得到在 氮氣氣氛下、80°C下聚合2小時而成的聚合物組合物。將所得到的聚合物組合物用水以及 丙酮進行清洗，由此，得到在基材微粒子的表面上具有離子交換基團的親水性的包覆聚合 物粒子。關于所得到的包覆聚合物粒子，使用粒度分布計（Particle Sizing Systems公司 制、"Accusizer780"）進行測定，結(jié)果平均粒徑為ΙΟμπι。
[0060] 將所得到的包覆聚合物粒子IOg在溶存臭氧氣體濃度IOOppm的臭氧水300mL中 浸漬，攪拌30分鐘。攪拌結(jié)束后，使用離心分離機（日立制作所公司制、"Himac CR20G"）， 進行離心分離，除去上清液。重復該操作2次，對包覆聚合物粒子實施臭氧水處理，得到季 銨基和羧基共存的離子交換色譜法用填充劑。
[0061] 需要說明的是，關于臭氧水，使用在具有內(nèi)徑15cmX長度20cm的圓柱形的外套內(nèi) 包含收納有由全氟烷氧基樹脂構(gòu)成的內(nèi)徑〇. 5mmX厚度0. 04mmX長度350cm的中空管狀 的臭氧氣體透過膜400根的臭氧溶解模塊的臭氧水制造系統(tǒng)（積水化學工業(yè)公司制）進行 制備。
[0062] 使用所得到的離子交換色譜法用填充劑，準備以下的色譜柱（陰離子交換色譜柱 2) 〇
[0063] 色譜柱尺寸：內(nèi)徑4. 6mmX 20mm
[0064] 離子交換基團：季銨基
[0065] 使用準備的陰離子交換色譜柱，在以下的條件下分離檢測目標核酸。
[0066] 系統(tǒng)：LC-20A系列（島津制作所公司制）
[0067] 洗脫液：A液25mmol/L Tris鹽酸緩沖液（pH7. 5)、B液實施例以及比較例中制備 的洗脫液
[0068] 溶出法：根據(jù)表1所示的梯度條件，用0分鐘至20分鐘使B液的混合比率直線增 加。
[0069] 檢體：20bpDNALadder 標記物（寶生物公司制、包括 20、40、60、80、100、120、140、 160、180、200、300、400、500bp 的片段）
[0070] 流速：0· 5mL/分鐘（陰離子交換色譜柱I)、1.0 mL/分鐘（陰離子交換色譜柱2)
[0071] 檢測波長：260nm
[0072] 試劑注入量：10 μ L
[0073]
[0074] 將使用實施例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱1得到的色譜圖示于圖1，將 使用實施例1的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖示于圖2,將使用實施例 2的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖示于圖3,將使用比較例1的離子交 換色譜法用洗脫液和色譜柱1得到的色譜圖示于圖4,將使用比較例1的離子交換色譜法 用洗脫液和色譜柱2得到的色譜圖示于圖5,將使用比較例2的離子交換色譜法用洗脫液 和色譜柱1得到的色譜圖示于圖6,將使用比較例2的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2 得到的色譜圖示于圖7,將使用比較例3的離子交換色譜法用洗脫液和色譜柱2得到的色譜 圖示于圖8。需要說明的是，圖1~8的圖中的數(shù)值為片段的堿基長（bp)的值。
[0075] 根據(jù)圖1~8,在使用實施例的離子交換色譜法用洗脫液的情況下，能夠分離檢體 中包含的全部片段。因此可知，不依賴色譜柱的種類，分離性能均有效地得到提高。另一方 面可知，在使用比較例的離子交換色譜法用洗脫液的情況下，根據(jù)色譜柱的種類和添加的 鹽的種類，雖然觀察到些許不同，但HObp以下的片段的分離不充分。
[0076] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0077] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在短時間并且以高分離性能進行核酸的PCR擴增產(chǎn) 物、該PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶片段、核酸的限制性內(nèi)切酶片段等目標核酸的分離檢 測的離子交換色譜法用洗脫液。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠通過使用上述離子交換色 譜法用洗脫液的離子交換色譜分析法在短時間精度良好地分析核酸鏈的分析方法。
【主權(quán)項】
1. 一種離子交換色譜法用洗脫液在核酸鏈的分離方法中的用途，其中， 所述離子交換色譜法用洗脫液含有由下述式（1)所示的胍衍生的胍鹽， 所述核酸鏈的分離方法按照鏈長將目標核酸中包含的核酸鏈進行分離，其具有： 將目標核酸導入至填充有陽離子性填充劑的陰離子交換柱中的工序，和 使用離子交換色譜法用洗脫液將目標核酸從陰離子交換柱溶出，從而按照鏈長將核酸 鏈分離的工序，〇2. -種離子交換色譜法用洗脫液，其含有胍鹽酸鹽或胍硫酸鹽， 且進一步含有選自Tris緩沖液、TE緩沖液、TAE緩沖液以及TBA緩沖液中的至少一種 緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠在短時間并且以高性能進行核酸的PCR擴增產(chǎn)物、該PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶片段、或核酸的限制性內(nèi)切酶片段等目標核酸的分離檢測的離子交換色譜法用洗脫液。另外，本發(fā)明提供基于使用了該洗脫液的離子交換色譜法的核酸鏈的分析方法。一種離子交換色譜法用洗脫液，其中，含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍鹽。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN104946626
【申請?zhí)枴緾N201510300454
【發(fā)明人】與谷卓也, 牛澤幸司
【申請人】積水醫(yī)療株式會社
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2012年1月12日
【公告號】CN103314290A, CN103314290B, EP2672265A1, EP2672265A4, US20130330735, WO2012096327A1