一種植物花粉特異性啟動(dòng)子pchf32及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種植物花粉特異性啟動(dòng)子PCHF32 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在基因的結(jié)構(gòu)與功能研宄中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是一個(gè)關(guān)鍵步驟，基因轉(zhuǎn)錄起始是 一系列反式作用因子和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)共同作用的結(jié)果。編碼蛋白質(zhì)的基因包含啟動(dòng)子和編碼 區(qū)，啟動(dòng)子一般位于編碼區(qū)上游，是反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)，有兩個(gè)主要區(qū)域：核心啟動(dòng) 子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。核心啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始的最短啟動(dòng)子片段，一般為40nt，包含核 心啟動(dòng)子元件，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控 區(qū)域位于核心啟動(dòng)子的上游（或下游），可與特異的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合從而對(duì)轉(zhuǎn)錄的時(shí)空、強(qiáng) 弱起調(diào)控作用，如增強(qiáng)子和沉默子等。啟動(dòng)子具有如下特征：1)序列特異性。啟動(dòng)子含有 保守的序列框，序列框中堿基的變化會(huì)影響轉(zhuǎn)錄水平。2)方向特異性。啟動(dòng)子是一種有方 向性的順式調(diào)控因子，分單向啟動(dòng)子和雙向啟動(dòng)子兩類。3)位置特異性。啟動(dòng)子一般位于 基因編碼區(qū)或功能區(qū)的上游。4)種屬特異性。不同物種具有不同類型的啟動(dòng)子。5)功能 特異性。不同組織和不同生化途徑具有不同類型的啟動(dòng)子。核心啟動(dòng)子經(jīng)典保守序列有 以下四種：1)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（initiator, Inr)。通常位于翻譯起始密碼子（AUG)上游-40 到-70bp處。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并無(wú)十分嚴(yán)格的同源順序，常見(jiàn)的保守序列是處于+1的A和+3 的T。TFIID和TFII-I等轉(zhuǎn)錄因子可識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。2) TATA box。是核心 元件，是RNA聚合酶II的識(shí)別位點(diǎn)，也是與一些反式作用因子結(jié)合的位點(diǎn)之一。植物啟動(dòng) 子的TATA box -般位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游32±7bp處，其保守序列為5'T37C42A38C 47T96A97T9QA94 T53A95T63A71G413'。TATA box通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子TFIID的識(shí)別結(jié)合而決定RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的 位點(diǎn)，形成前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并起動(dòng)轉(zhuǎn)錄。TATA box還決定轉(zhuǎn)錄的方向以及介導(dǎo)上下游元件對(duì) 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。3)CAAT box，是一種增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的元件。一般位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的-75bp附 近，其保守序列為GGC/TCAATCT。CAAT box與控制轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)。4) GC box，通常位于 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的_90bp附近，其保守序列為GGGCGG，可有多個(gè)拷貝，須與轉(zhuǎn)錄因子SPl互作才 能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。
[0003] 啟動(dòng)子按其表達(dá)方式可分為三類：組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟 動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在生物體各個(gè)發(fā)育時(shí)期和所有的組織中都啟動(dòng)基因表達(dá)，具有時(shí)空持 續(xù)性和表達(dá)量恒定性。大多數(shù)組成型啟動(dòng)子中存在六聚體TGACTG，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 IOObp左右，并往往重復(fù)出現(xiàn)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能在某些物理或化學(xué)信號(hào)的誘導(dǎo)下啟動(dòng)基因表 達(dá)，或可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。它們具增強(qiáng)子、沉默子或類似功能的序列結(jié)構(gòu)， 并有明顯的專一性。一部分誘導(dǎo)型啟動(dòng)子同時(shí)具組織特異性，該類啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號(hào)命 名，如光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子、低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子、干旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子、 激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子只在某種細(xì)胞、組織或者器官中啟動(dòng)基因表達(dá)。 其結(jié)構(gòu)上通常存在組織特異性增強(qiáng)子和沉默子，因而調(diào)控基因在特定的組織或器官中的轉(zhuǎn) 錄水平。這些啟動(dòng)子還往往表現(xiàn)出化學(xué)物理信號(hào)誘導(dǎo)性，還受到組織細(xì)胞生理狀態(tài)以及發(fā) 育階段的影響。這種類型的啟動(dòng)子有根特異性啟動(dòng)子、維管束特異性啟動(dòng)子、莖桿和葉片特 異性啟動(dòng)子、花特異性啟動(dòng)子、種子和果實(shí)特異性啟動(dòng)子等。
[0004] 隨著大量DNA序列的積累和各種基因數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，有關(guān)啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)及鑒定 和分析的計(jì)算機(jī)軟件和網(wǎng)站也相繼產(chǎn)生，如GENESCAN(http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)，GENEFINDER(http://rulai.cshl.edu/tools/genefinder/)，PROMOTER SCAN(ver I. 7http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan), TESS(http://searchlauncher, bcm. tmc. edu/seq-search/gene-search. html), Match (http://www.generegulation. com/ cgi-bin/pub/programs/match/match. cgi)，AliBata 2. I (http://www. gene-regulation. com/pub/programs/alibaba2/index, html), ppdb(plant promoter database, http:// www.ppdb.gene.nagoya_u.ac.jp)以及 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan.html)等。啟動(dòng)子克隆的方法也很多，其中PCR是很常用的手段，如環(huán)狀PCR包 括 I-PCRQnverse PCR)、P-PCR(panhandle PCR)，TAIL-PCR 和反向 PCR 等。目前，許多植物 啟動(dòng)子已被克隆，并已申請(qǐng)了專利保護(hù)。但在水稻花粉特異啟動(dòng)子方面，所見(jiàn)報(bào)道不多。
[0005] 水稻是我國(guó)的民族產(chǎn)業(yè)，研宄水稻開花機(jī)理意義重大。水稻的花粉形成發(fā)生在雄 蕊中的花藥中，花藥含有生殖細(xì)胞，這些生殖細(xì)胞形成絨氈層和花粉母細(xì)胞。絨氈層為雄配 子體的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，包括各種酶類和非酶類蛋白質(zhì)，并參與花粉外壁的合成?；ǚ勰讣?xì)胞 則進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生四分體。四分體中的單細(xì)胞經(jīng)絨氈層分泌胼胝酶的作用分離產(chǎn)生單 倍體小孢子體。單倍體小孢子體進(jìn)一步發(fā)育，到晚期時(shí)形成中央大液泡。中央大液泡將細(xì) 胞核排擠到細(xì)胞邊緣（稱為單核靠邊期），形成細(xì)胞極性。這種細(xì)胞極性的促進(jìn)小孢子體進(jìn) 行一次不等有絲分裂，產(chǎn)生一個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)小的生殖細(xì)胞。小的生殖細(xì)胞被完全包 含在大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，形成細(xì)胞中細(xì)胞的特異現(xiàn)象。生殖細(xì)胞將進(jìn)行第二次有絲分裂，產(chǎn)生 兩個(gè)精細(xì)胞，形成成熟的花粉粒。我們利用公共DND序列和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，找到了水稻花器 特異表達(dá)基因，并通過(guò)DNA序列分析，得到了啟動(dòng)子區(qū)域，其中一些基因經(jīng)過(guò)RT-PCR和轉(zhuǎn)基 因驗(yàn)證后，確定為水稻花粉特異啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子為水稻的基因工程，特別是在控制育性 和轉(zhuǎn)基因漂移等方面提供了新的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種植物花粉特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的一種植物花粉特異性啟動(dòng)子PCHF32,其為具有：
[0008] 1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，
[0009] 或2)在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸 且具有同等花粉特異性啟動(dòng)功能的由1)衍生的核苷酸序列。
[0010] 其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，與1)所述的核苷酸序列為與1)相比具 有70%以上同源性，且具有同等花粉特異性啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。2)所述的由1)衍 生的核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 1自第1500位至第2038位所示的核苷酸序列，已被驗(yàn)證 具有與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列同等的花粉特異性啟動(dòng)子功能。
[0011] 本發(fā)明提供含有本發(fā)明所述植物花粉特異性啟動(dòng)子PCHF32的重組表達(dá)載體。本 發(fā)明提供了含有上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明還提供與植物花粉特異性啟動(dòng)子PCHF32核苷酸序列互補(bǔ)的DNA分子。本 領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用與植物花粉特異性啟動(dòng)子PCHF32核苷 酸序列互補(bǔ)的DNA分子，因此，具有啟動(dòng)子活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明啟動(dòng)子序列或其 片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。
[0013] 其中，所述核苷酸序列互補(bǔ)，是指在嚴(yán)格條件下能與PCHF32雜交。
[0014] 嚴(yán)格條件是指探針將與其靶序列雜交至可探測(cè)程度超過(guò)與其它序列雜交（如至 少2倍于背景）的條件。嚴(yán)格條件具有序列依賴性，且因環(huán)境的不同而不同。通過(guò)控制雜交 和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列（同源探測(cè)）?？蛇x擇地， 可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許一些序列錯(cuò)配，使得探測(cè)到較低程度的相似性（異源探測(cè)）。通 常，探針長(zhǎng)度短于大約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地短于500個(gè)核苷酸。
[0015] 典型地，嚴(yán)格條件是在pH值7