高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌蛋白質(zhì)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] ：本發(fā)明涉及河蛘蛋白質(zhì)的高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取技術(shù)，特別是涉 及利用響應(yīng)曲面優(yōu)化河蚌蛋白質(zhì)提取條件的方法。
【背景技術(shù)】 [0002] ：河蚌，是貝殼類水牛動(dòng)物的一種，屬瓣腮綱、珍珠科，是中國(guó)特有資源。 河蚌早在醫(yī)學(xué)記載就可用于清熱消炎，具有明目、除濕、止消渴的功效，且可滋陰養(yǎng)肝，并具 有降血糖、降血脂、提高免疫力、抗衰老等保健作用?，F(xiàn)代研宄表明，河蚌肉高蛋白、低脂肪， 富含人體必需多種氨基酸、不飽和脂肪酸和礦物元素。因此，河蚌肉可作為食材和藥材為人 體利用，具有良好保健功效，具有重要的研宄價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于肉類蛋白的研宄較多，但大多集中在牛肉、雞肉、豬肉、魚肉等 蛋白的開發(fā)研宄，關(guān)于河蚌蛋白的研宄鮮有報(bào)道。國(guó)內(nèi)河蚌養(yǎng)殖業(yè)逐漸擴(kuò)大，季節(jié)性較強(qiáng)， 且易于腐敗變質(zhì)，運(yùn)輸貯藏困難，嚴(yán)重影響蚌肉消費(fèi)，有相當(dāng)一部分被直接丟棄，造成資源 浪費(fèi)。蚌肉本身腥味較重，且肉質(zhì)較粗韌，烹飪后口感較硬，味道欠佳，使得蚌肉直接食用和 開發(fā)利用受到一定的限制。因此，以蚌肉為原料，開發(fā)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的河蚌蛋白粉，不僅可以 充分利用國(guó)內(nèi)河蚌資源，且可滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的消費(fèi)需求，研宄開發(fā)潛力較大。
[0004] 目前，肉類蛋白提取方法主要有鹽法、酸堿法、酶解法等。鹽提法易于操作，由于浸 提液PH值接近中性，對(duì)蛋白質(zhì)破壞較小，但提取效率較低，耗時(shí)長(zhǎng)；酸堿法是利用其pH值偏 離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)來提取的，提取效率較高，但酸堿消耗量較大，且反應(yīng)環(huán)境過酸或過堿會(huì)使 蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生改變，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變；酶提法反應(yīng)條件較溫和，對(duì)蛋 白質(zhì)破壞較小，提取效率也較高。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] ：基于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷,本發(fā)明旨在提供一種以河蚌肉為原料, 利用高壓脈沖電場(chǎng)與蛋白酶水解相結(jié)合方法提取河蚌蛋白質(zhì)。該方法工藝簡(jiǎn)單、提取率高、 條件溫和、節(jié)約資源、耗時(shí)少，可實(shí)現(xiàn)河蚌肉蛋白質(zhì)的高效快速提取。
[0006] 其工藝流程及其控制條件如下：
[0007] A.原料及處理：新鮮的河蚌用水清洗其表面泥污，用刀將其剖開，去除蚌殼、蚌淚 及內(nèi)臟組織，取蚌肉用清水清洗干凈，瀝除其表面水分，_18°C以下冷凍備用。
[0008] B.打漿：將冷凍的蚌肉從冰柜中取出，室溫下解凍，用打漿機(jī)打漿。
[0009] C.均質(zhì)：將打漿后的蚌肉漿液置于膠體磨中均質(zhì)，得到均一的蚌肉漿液。
[0010] D.高壓脈沖電場(chǎng)預(yù)處理：底物濃度以蚌肉中總蛋白含量計(jì)算，加入一定比例的蒸 餾水，調(diào)節(jié)底物濃度為4%，將料液混合均勻，以lOmL/min流速經(jīng)蠕動(dòng)泵泵送高壓脈沖電場(chǎng) 處理室，電場(chǎng)強(qiáng)度15-25kV/cm，脈沖數(shù)6-10個(gè)。
[0011] E.酶解提取：調(diào)節(jié)經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)預(yù)處理后的漿液pH至5. 5,加入酶活4000U/g 蛋白質(zhì)的木瓜蛋白酶，攪拌均勻后于50°C恒溫水浴振蕩器中酶解反應(yīng)I. 5-2. 5h，酶解過程 中保持反應(yīng)體系pH值恒定在5. 5左右，反應(yīng)結(jié)束后迅速于沸水浴中加熱10-15min以使酶 失活，滅酶后將反應(yīng)物置于冷水中冷卻至室溫。
[0012] F.分離：將經(jīng)滅酶和冷卻后的蚌肉酶解液置于低速離心機(jī)中離心（4000r/min， IOmin)，取上清液，即為蚌肉蛋白提取液。
[0013] G.除腥：在蚌肉蛋白提取液中加入1% (質(zhì)量體積比）活性干酵母，混合均勻后， 于35°C恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)60min，將經(jīng)除腥處理后的反應(yīng)物進(jìn)行離心分離（lOOOOr/ min，IOmin)，上清液即為除腥后的蚌肉蛋白提取液。
[0014] H.濃縮：將得到的除腥后的蚌肉蛋白提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在50°C條件下減 壓濃縮至可溶性固形物含量為15% -25%，即為蚌肉蛋白濃縮液。
[0015] I.干燥：將蚌肉蛋白濃縮液經(jīng)噴霧干燥后即得河蚌蛋白粉。
[0016] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0017] 1.本發(fā)明以松花江野生河蚌肉為原料，對(duì)合理利用野生河蚌資源，變廢為寶，提高 產(chǎn)品附加值、擴(kuò)大淡水資源開發(fā)及節(jié)能環(huán)保具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的社會(huì)意義；
[0018] 2.本發(fā)明首次采用高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌蛋白質(zhì)，使河蚌肉中蛋白質(zhì)更 易溶出提取，真正達(dá)到高效提取。
[0019] 3.本發(fā)明得到的河蚌蛋白質(zhì)，可作為一種新資源食品添加劑應(yīng)用于食品、飲料、蛋 白粉沖劑和保健食品等各領(lǐng)域。
【附圖說明】：
[0020] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021] 圖1是電場(chǎng)強(qiáng)度變化對(duì)蛋白提取率的影響規(guī)律圖；
[0022] 圖2是脈沖數(shù)變化對(duì)蛋白提取率的影響規(guī)律圖；
[0023] 圖3是酶解時(shí)間變化對(duì)蛋白提取率的影響規(guī)律圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1、高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌蛋白質(zhì)工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
[0025] 1、樣品準(zhǔn)備與試驗(yàn)過程
[0026] (1)新鮮河蚌用水清洗其表面泥污，用刀將其剖開，去除蚌殼、蚌淚及內(nèi)臟組織，取 蚌肉用清水清洗干凈，瀝除其表面水分，用打漿機(jī)打漿，將打漿后的蚌肉漿液置于膠體磨中 均質(zhì)，得到均一的蚌肉漿液，即為河蚌肉樣品。
[0027] (2)稱取25g河蚌肉樣品，加入一定比例蒸餾水，使反應(yīng)體系中總蛋白濃度為4%， 將樣液用懦動(dòng)泵以10mL/min流速泵送高壓脈沖電場(chǎng)處理室，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度（kV/cm)和 脈沖數(shù)（個(gè)）條件下進(jìn)行脈沖電場(chǎng)處理。
[0028] (3)調(diào)節(jié)pH至5. 5,加入4000U/g木瓜蛋白酶，混勾后置于50°C恒溫水浴振蕩器中 酶解I. 5-2. 5h，酶解過程中保持反應(yīng)體系pH值恒定在5. 5左右，反應(yīng)結(jié)束后迅速于沸水浴 中滅酶10min，并將反應(yīng)物置于冷水中冷卻至室溫。
[0029] (4)離心（4000r/min、IOmin)取上清液，用蒸餾水將上清液稀釋到一定倍數(shù)，用雙 縮脲法測(cè)定上清液中可溶性蛋白濃度。
[0030] (5)蛋白提取率計(jì)算公式為：蛋白提取率（％) =[測(cè)得的可溶性蛋白濃度X稀 釋倍數(shù)X上清液體積/蚌肉質(zhì)量X蚌肉蛋白含量]X 100%。
[0031] 2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0032] (1)單因素試驗(yàn)
[0033] 以電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、酶解時(shí)間為主要影響因素，河蚌蛋白提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因 素試驗(yàn)，每次試驗(yàn)平行測(cè)定三次，取其平均值。
[0034] (2)響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0035] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)蛋白提取效果影響較顯著的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、酶解 時(shí)間這三個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并利用design expert軟件進(jìn)行數(shù) 據(jù)處理，建立二次多項(xiàng)回歸模型，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表 如表1。
[0036] 表1響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)變量與編碼表
[0038] 以電場(chǎng)強(qiáng)度（X1)、脈沖數(shù)（X2)和酶解時(shí)間（X 3)為自變量，以河蚌蛋白提取率為響 應(yīng)值（Y)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。試驗(yàn)點(diǎn)1-12為析因點(diǎn)，13-17是零點(diǎn)。
[0039] 表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果
[0041] (3)模型的建立和統(tǒng)計(jì)分析
[0042] 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到響應(yīng)變量（電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和酶解時(shí)間）與 響應(yīng)值（蛋白提取率）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：
[0043] Y = -2. 65+3. 32575XJ4. 18312Χ2+29· 63Χ3+0· 0175XA-0. 167X^3
[0044] -0· 2575Χ2Χ3-0· 0809Χ/-0. 24562Χ/-5. 86Χ32
[0045] F檢驗(yàn)可判定各因子與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著性，P值越小，說明變量越顯著。 由方差分析表（表3)可知，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R 2=O. 9931)，模 型的顯著水平小于0. 0001，所以該回歸方差模型極顯著。
[0046] 表3響應(yīng)面二次回歸模型方差分析表
[0048] (4)試驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化
[0049] 模型分析可知，高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌蛋白質(zhì)最佳工藝參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng) 度19. 29kV/cm，脈沖數(shù)8