一種從復(fù)雜環(huán)境樣品篩選與計(jì)數(shù)產(chǎn)淀粉酶真菌的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種從復(fù)雜環(huán)境樣品篩選與計(jì)數(shù)產(chǎn)淀粉酶真菌的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]復(fù)雜環(huán)境樣品如土壤樣品，酒曲樣品等含有眾多數(shù)量和種類的微生物，各種功能相同或者相近的微生物集合體構(gòu)成了不同的微生物功能群，如本發(fā)明關(guān)注的淀粉降解微生物功能群。微生物功能群的研宄在工業(yè)，農(nóng)業(yè)，微生物治理，醫(yī)學(xué)和基因工程方面均有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]研宄微生物功能群其中重要的方法包括應(yīng)用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。但是該種方法在培養(yǎng)過(guò)程中主要面臨三個(gè)問(wèn)題:環(huán)境樣品成分復(fù)雜，細(xì)菌眾多，容易造成污染；真菌生長(zhǎng)速度太快，很快占領(lǐng)整個(gè)平板培養(yǎng)基，這樣真菌之間的界限很難確定，不能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；真菌種類眾多，不能直觀的選擇出目標(biāo)微生物，例如產(chǎn)淀粉酶真菌。對(duì)于產(chǎn)淀粉酶真菌的篩選，現(xiàn)有報(bào)道中的解決辦法一般是分兩步完成:先用含有細(xì)菌抗生素的真菌培養(yǎng)基如馬鈴薯培養(yǎng)、查氏培養(yǎng)基、或者馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基分離所有優(yōu)勢(shì)真菌，然后將分離到的真菌接種到淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定。但是該種方法需要配制大量培養(yǎng)基，總培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，工作量大。對(duì)于產(chǎn)淀粉酶真菌的計(jì)數(shù)則少有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)淀粉酶真菌計(jì)數(shù)與篩選培養(yǎng)基的不足，提出一種對(duì)于產(chǎn)淀粉酶真菌快速培養(yǎng)、分離計(jì)數(shù)與篩選的新型培養(yǎng)基，該種培養(yǎng)基是含細(xì)菌和真菌抗生素混合的培養(yǎng)基，具有能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，能一次對(duì)復(fù)雜環(huán)境中產(chǎn)淀粉酶真菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離、計(jì)數(shù)，且配制簡(jiǎn)單，計(jì)數(shù)操作簡(jiǎn)單易行。
[0005]本發(fā)明新型培養(yǎng)基的配制與篩選步驟:
[0006]1、配制下述培養(yǎng)基
[0007](I)配制S培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，其成分為NaN032g，K2HP04lg，KCl 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.0lg，可溶性淀粉 10g，瓊脂 15g，曲利苯藍(lán) 0.lg，水 100mL ；
[0008]配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后補(bǔ)足水分至1000mL。121°C滅菌30min，待用。
[0009](2)配制5種細(xì)菌抗生素培養(yǎng)基(共8種)
[0010]a) SC培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基中加氯霉素至終濃度97.5mg/L)，
[0011]b)SK培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基中加卡那霉素至終濃度分別為18 μ g/mL、36 μ g/mL、54 μ g/mL、72 μ g/mL，分別編號(hào)為 SKl、SK2、SK3、SK4。)，
[0012]c)SP培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基中加氨芐青霉素至終濃度112.5mg/L)，
[0013]d) SS培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基中加鏈霉素至終濃度30mg/L)，
[0014]e) ST培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基中加四環(huán)霉素至終濃度30mg/L)。
[0015](3)配制含細(xì)菌和真菌抗生素混合培養(yǎng)基(共16種)
[0016]在SK3培養(yǎng)基中加入制霉菌素溶液至終濃度分別為0.9 μ g/mL、1.8 μ g/mL、
3.6 μ g/mL,7.2 μ g/mL，編號(hào)為 SK3N1、SK3N2、SK3N3，SK3N4 ; (4 種)
[0017]在SK3培養(yǎng)基中加入酮康唑溶液至終濃度分別為2.5 μ g/mL, 5.0 μ g/mL,10.0 μ g/mL，編號(hào)為 SK3K1、SK3K2、SK3K3 ; (3 種)
[0018]在SK3培養(yǎng)基中加入兩性霉素溶液至終濃度分別為0.0Syg/mU0.10 μ g/mL,
0.20 μ g/mL，編號(hào)為 SK3A1、SK3A2、SK3A3 ; (3 種)
[0019]在SK3培養(yǎng)基中加入灰黃霉素溶液至終濃度分別為0.3 μ g/mL,0.6 μ g/mL,
1.2 μ g/mL，編號(hào)為 SK3G1、SK3G2、SK3G3 ; (3 種)
[0020]在SK3培養(yǎng)基中加入克霉唑溶液至終濃度分別為1.0 μ g/mL,2.0 μ g/mL,4.0 μ g/mL，編號(hào)為 SK3CU SK3C2、SK:3C3。(3 種)
[0021](4)配制其他培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(S)中按馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基配方加入孟加拉紅稀釋液至終濃度33mg/L，加入鏈霉菌素稀釋液至終濃度30 μ g/mL。(I種)
[0022]2、白云邊中溫大曲樣品的處理
[0023]取粉碎后的白云邊中溫大曲樣品10g，置于裝有90mL無(wú)菌水帶玻璃珠的三角瓶中，在37°C的搖床中(120r/min)，震蕩30min。將處理好的樣品，進(jìn)行系列稀釋，取10_2、10_3和10_4為最終涂布平板濃度。
[0024]3、真菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)
[0025]3.1細(xì)菌抗生素種類的篩選
[0026]取活化的白云邊中溫大曲菌懸液10_2、10_3和10 _4三個(gè)梯度各100 μ L，在SC、SP、
SS、ST、SK3培養(yǎng)基上涂布平板，并S培養(yǎng)基平板為空白對(duì)照。每種處理3個(gè)重復(fù)。28°C培養(yǎng)。每隔12h觀察菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)。(共6*3*3 = 54次)
[0027]對(duì)照培養(yǎng)基S上2?3d后長(zhǎng)滿細(xì)菌，數(shù)量大于為350個(gè)，如圖1。而加入了細(xì)菌抗生素的平皿培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)目均為個(gè)位數(shù)，不影響真菌計(jì)數(shù)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)所加入的細(xì)菌抗生素均能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，分離得到真菌一共有4種，其中I種數(shù)量占絕大數(shù)，另外3種每個(gè)平皿培養(yǎng)基上僅有I?2個(gè)菌落。培養(yǎng)基SP、ST、SS、SC上菌落形態(tài)基本一致，菌絲絲絨狀，為白色，，貼附于培養(yǎng)基表面，菌落不規(guī)則，如圖2、3、4、5 ;培養(yǎng)基SK3上菌落在培養(yǎng)4d后仍較小且規(guī)則，如圖6。因此，最優(yōu)培養(yǎng)基為添加卡那霉素的培養(yǎng)基SK3。
[0028]3.2卡那霉素濃度的篩選
[0029]為篩選最適卡那霉素濃度取活化的白云邊中溫大曲菌懸液10_2、10_3和10_4三個(gè)梯度各100 μ L，在SKl、SK2、SK3、SK4培養(yǎng)基上涂布平板，S培養(yǎng)基平板為空白對(duì)照。每種處理3個(gè)重復(fù)。28°C培養(yǎng)。每隔12h觀察菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)。(共4*3*3 = 36次)
[0030]對(duì)照組培養(yǎng)基S上I?2d后細(xì)菌布滿平板如圖7。培養(yǎng)3d后，SKl培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)少量細(xì)菌菌落，如圖8 ;SK2、SK3、SK4培養(yǎng)基平板無(wú)細(xì)菌菌落出現(xiàn)，如圖9_11。培養(yǎng)5d后，SK2和SK3培養(yǎng)基平板上真菌菌落菌落邊緣清晰，形態(tài)較規(guī)則；培養(yǎng)基SK4上真菌數(shù)目仍較少，到6?7d真菌數(shù)目接近35個(gè)。故培養(yǎng)基中抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最適卡那霉素濃度為54 μ g/mLο
[0031]3.3真菌抗生素種類和濃度的篩選
[0032]為篩選最適真菌抗生素，取活化的白云邊中溫大曲菌懸液10_2、10_3和10 _4三個(gè)梯度各 100 μ L，分別在 SK3N1—4、SK3K1—3、SK3A1—3、SK3G1—3 和 SK3C1—3 培養(yǎng)基上涂布平板。每種處理3個(gè)重復(fù)。28°C培養(yǎng)。每隔12h觀察菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)。(共16*3*3 = 144次)2d后，SK3K1—2培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)真菌。培養(yǎng)3d后，SK3K1—3培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上真菌菌落較小，絲狀，難以計(jì)數(shù)，其中SK3K1培養(yǎng)基平板真菌菌落如圖12。SK3C1—3培養(yǎng)基平板在5d后真菌菌落僅有幾個(gè)，其中SK3C1培養(yǎng)基平板如圖13。SK3G1—3培養(yǎng)基平板培養(yǎng)近2d后占據(jù)整個(gè)平板，其中SK3G3培養(yǎng)基平板真菌菌落生長(zhǎng)如圖14。SK3A1-3培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)近2d后開始出現(xiàn)真菌菌落，菌落較小，不規(guī)則，不容易計(jì)數(shù)