ication nfo Kits購(gòu)自TwistDX公司，側(cè)流層析試紙條（HybriDetect Dipsticks)購(gòu)自Milenia公司，其 他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
[0038] 2.實(shí)驗(yàn)儀器
[0039] 恒溫水浴鍋，離心機(jī)，掌上離心機(jī)，渦旋儀等。
[0040] 實(shí)施例一、引物與探針的設(shè)計(jì)和篩選
[0041] 目前，RPA-LFD引物與探針的設(shè)計(jì)沒(méi)有具體的操作規(guī)則，必須經(jīng)過(guò)RPA反應(yīng)后應(yīng)用 側(cè)流層析試紙條（LFD)檢測(cè)，才能篩選獲得可用于臨床檢測(cè)的引物與探針。
[0042] RPA引物的長(zhǎng)度一般為30-35nt，引物過(guò)短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性。長(zhǎng)引物并不 一定能提高擴(kuò)增性能，反而還會(huì)增加形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性。實(shí)驗(yàn)中需要從靶標(biāo)序列兩端 設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化，篩選，個(gè)別堿基的替換或增減都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。但是 還是有一些注意點(diǎn)：（1) 5'端的3-5個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥嘌呤（G)，胞嘧啶（C)，這樣能 促引物與擴(kuò)增靶基因的結(jié)合。對(duì)于3'末端的3個(gè)核苷酸來(lái)說(shuō)，鳥嘌呤和胞嘧啶有助于聚合 酶的穩(wěn)定結(jié)合，可以提升引物的擴(kuò)增性能。（2)引物中最好不要出現(xiàn)特殊序列，比如長(zhǎng)串的 聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量過(guò)高（>70% )或過(guò)低（〈30% )都不利于RPA擴(kuò)增。（3)此外，弓丨 物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量避免容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物-引物互作、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，減少引物二 聚體的形成。
[0043] 本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)布魯氏菌保守的VirB9、VirBlO和VirBll基因 （GengBank No. AF226278)設(shè)計(jì)了 2條特異性探針，在探針的兩側(cè)設(shè)計(jì)了 4條正向引物和2條反向引物。 以牛種布魯氏菌DNA為模板對(duì)10種不同引物組合進(jìn)行篩選，最終選出一組擴(kuò)增效率高，特 異性強(qiáng)的引物與探針組合，用于RPA-LFD檢測(cè)，引物和探針序列分別見(jiàn)SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 (表 1)。
[0044] 表 1
[0046] 注：Biotin :生物素標(biāo)記；FAM :羧基熒光素標(biāo)記；dSpacer :核苷酸堿基類似物，是 nfo核酸酶切割位點(diǎn)；C3-Spacer :聚合酶延伸阻斷物。
[0047] 實(shí)施例二、布魯氏菌RPA-LFD檢測(cè)方法的建立及臨床樣本的檢測(cè)
[0048] L實(shí)驗(yàn)步驟
[0049] (1)細(xì)菌基因組DNA的提取和臨床樣本現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)DNA模板的制備
[0050] 取Iml菌液，按照天根生化科技（北京）有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō) 明書進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取。
[0051] 將臨床組織樣本用 200 μ L TE 緩沖液（1.0 M Tris-HCl (ρΗ8· 0) 10mL，0· 5M Na2EDTA · 2H20(pH8. 0)2mL，加蒸餾水至1000 mL)重懸，液體樣本直接取200 yL，然后加入 30yL 10% (w/v)SDS 和 3yL 2% (w/v)蛋白酶 K，混合后 37°C 溫育 lh。
[0052] (2)布魯氏菌RPA-LFD反應(yīng)體系的建立
[0053] RPA反應(yīng)體系為50 yL :
[0054]
[0055] 待測(cè)樣本DNA或粗裂解產(chǎn)物和CldH2O 13. 2 yL
[0056] 將上述混合物加入Twi stAmp nfo反應(yīng)管，充分混勾、溶解。然后加入2. 5 μ L醋酸 鎂溶液，將反應(yīng)管置于38°C水浴中，處理25min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μ L與98 μ L的LFD檢測(cè) 緩沖液混合，將LFD浸入上述混合液，5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，若同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶， 貝IJ該樣品含有布魯氏菌，僅出現(xiàn)對(duì)照條帶，則說(shuō)明該樣品中不含布魯氏菌，僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶 或者無(wú)條帶則說(shuō)明RPA-LFD檢測(cè)不成立。
[0057] (3)布魯氏菌RPA-FLD敏感性檢測(cè)
[0058] 利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算牛種布魯氏菌菌液濃度，分別以10倍倍比稀釋成 6. OX 108-6. OX lO'fu/mL菌液，取相應(yīng)稀釋倍數(shù)的菌液各lmL，采用細(xì)菌基因組DNA提取 試劑盒提取各稀釋倍數(shù)的菌液基因組DNA，用100 μ L TE溶解，取2 μ L基因組DNA為模板進(jìn) 行RPA擴(kuò)增，同時(shí)以CldH2O為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)本方法的敏感性。
[0059] (4)布魯氏菌RPA-FLD特異性檢測(cè)
[0060] 以步驟（2)建立的RPA-FLD方法分別對(duì)牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌、豬種布魯氏 菌、綿羊種布魯氏菌、犬種布魯氏菌，大腸桿菌0157:Η7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏 菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以CldH 2O為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)本方法的特異性。
[0061] (5)臨床樣本布魯氏菌的RPA-FLD檢測(cè)
[0062] 分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的已經(jīng)用PCR擴(kuò)增后測(cè)序正確的12份布魯氏菌陽(yáng)性血液 DNA、12份布魯氏菌陽(yáng)性奶樣DNA以及2份布魯氏菌陰性血液DNA和2份布魯氏菌陰性奶樣 DNA為模板，同時(shí)以牛種布魯氏菌DNA和CldH2O分別為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，分別進(jìn)行RPA-LFD擴(kuò) 增檢測(cè)。
[0063] 2.試驗(yàn)結(jié)果
[0064] 用10種引物與探針組合進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)，篩選出1種最優(yōu)的引物和探針組合， 結(jié)果如圖1所示。以10倍倍比稀釋的10個(gè)梯度的牛種布魯氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行 檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，50 μ L體系的布魯氏菌通用型RPA-LFD的檢測(cè)限為6. 0 X 10°cfu。 以5株不同種屬的布魯氏菌基因組DNA和4株其他細(xì)菌基因組DNA作為對(duì)照，分別進(jìn)行 RPA-LFD檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，5株布魯氏菌反應(yīng)管在側(cè)流層析試紙條的檢測(cè)線處均出現(xiàn) 檢測(cè)條帶，均為陽(yáng)性結(jié)果；而其他4株細(xì)菌和CldH 2O對(duì)照均未出現(xiàn)檢測(cè)條帶，均出現(xiàn)對(duì)照條 帶，說(shuō)明RPA-LFD擴(kuò)增結(jié)果呈陰性。對(duì)24份布魯氏菌陽(yáng)性臨床樣本和4份陰性對(duì)照樣本進(jìn) 行了 RPA-LFD檢測(cè)，結(jié)果如圖4和表2所示。以上結(jié)果充分說(shuō)明用本發(fā)明提供的RPA-LFD 引物、探針以及試劑盒檢測(cè)布魯氏菌具有較高的靈敏度和特異性，最重要的是可以對(duì)臨床 樣本直接進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速的診斷。
[0065]表 2
[0068] 上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的通用型引物與探針，其特征在于：其正向引物序 列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探針序列如SEQIDNo. 3所示。2. 如權(quán)利要求1所述的引物和探針組合，其特征在于，所述正向引物序列如SEQIDNo. 1 所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探針序列如SEQIDNo. 3所示： SEQIDNo. 1 ： 5'-CAAGGTGTTGCTCTTTCTCTTTGTCGTGGGC-3' SEQIDNo. 2 ： 5'- (Biotin)-CGGAACTGTGCTGGTCTGCACCATCGTCTTG-3' SEQIDNo. 3 ： 5' FAM-CTTTGTCGTGGGCTTCATCGTCGTGCTGCTG(dSpacer) TGCTGCTCGTGTTTC-C3-Spacer3' 〇3. -種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包含權(quán)利要求1 所述的引物對(duì)和探針組合。4. 一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 檢測(cè)樣本DNA的提取或檢測(cè)樣本裂解處理； (2) 以步驟（1)中處理的樣本為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增； (3) 用側(cè)流層析試紙條檢測(cè)上述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣本中是否含有布 魯氏囷。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（2)中RPA擴(kuò)增體系為：RPA反應(yīng)體系 為50yL:包括2. IyL IOyM的上游引物、2. IyL IOyM的下游引物、0.6yL IOyM的探 針、29. 5 y L rehydration緩沖液、待測(cè)樣本DNA或粗裂解產(chǎn)物和CldH2O共計(jì)13. 2 y L ;將上 述混合液47. 5 y L加入TwistAmp nfo反應(yīng)管中，再加入2. 5 y L醋酸鎂溶液；擴(kuò)增程序?yàn)椋?于38攝氏度恒溫水浴中反應(yīng)25分鐘。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟⑶的具體步驟為：取2 y L RPA擴(kuò)增 產(chǎn)物與98 y L的LFD檢測(cè)緩沖液混合，將LFD置入上述混合液中，5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，若同 時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶，則該樣品布魯氏菌屬細(xì)菌感染陽(yáng)性，僅出現(xiàn)對(duì)照條帶則說(shuō)明 該樣品中不含布魯氏菌屬細(xì)菌，如果僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶或者無(wú)條帶則說(shuō)明RPA-LFD檢測(cè)不成 立。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的通用型引物與探針以及試劑盒，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明檢測(cè)布魯氏菌靈敏性高、特異性強(qiáng)，最低可以檢測(cè)6.0×100cfu的布魯氏菌，與大腸桿菌O157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)。本發(fā)明不僅可用于布魯氏菌菌株檢測(cè)，還可用于臨床樣本的檢測(cè)。臨床樣本主要包括血液、奶樣、氣溶膠樣本、組織樣本等。本發(fā)明所述的試劑盒使用方便，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，僅僅在38℃下，25min就能對(duì)待測(cè)樣本的粗裂解產(chǎn)物進(jìn)行布魯氏菌的靈敏、特異、快速地檢測(cè)，適合現(xiàn)場(chǎng)或基層布病檢疫工作。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/01
【公開號(hào)】CN104946749
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510293311
【發(fā)明人】何洪彬, 趙貴民, 王洪梅
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年6月1日