Brca1蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對mtx耐藥性的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及BRCAl蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用，具體 涉及BRCAl蛋白在制備通過下調(diào)DHFR基因擴(kuò)增進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對MTX耐藥性的藥物中 的應(yīng)用，屬于腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨甲蝶呤（Methotrexate, MTX)是惡性腫瘤治療中的一個有效的抗代謝 藥，是目前腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的葉酸拮抗劑，能競爭性地結(jié)合二氫葉酸還原酶 (Dihydrofolatereductase, DHFR)，抑制核苷酸代謝，從而阻斷DNA的合成、特異性地殺傷 增殖期細(xì)胞。雖然MTX已成為腫瘤治療的常用藥物，但是，由于長時(shí)間的用藥會導(dǎo)致耐藥性 的產(chǎn)生，從而嚴(yán)重影響藥物的療效，所以克服MTX耐藥是提高其腫瘤治療療效的關(guān)鍵。
[0003] MTX耐藥分為先天耐藥和獲得性耐藥。其中MTX獲得性耐藥的機(jī)制可以概 括為以下三類：第一、還原性葉酸載體（Reduced folate carrier, RFC)的缺失或功 能缺陷致使MTX的攝入量減少；第二、胞內(nèi)多聚谷氨酸合成酶（Folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)活性下降或表達(dá)降低導(dǎo)致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，產(chǎn)生耐藥； 第三、MTX的靶酶DHFR水平升高導(dǎo)致的耐藥，DHFR表達(dá)增強(qiáng)通常是由DHFR基因擴(kuò)增引起 的。
[0004] 基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)部某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，是基因組不穩(wěn) 定性的一種主要形式?；驍U(kuò)增會形成兩種主要的細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)，即染色體外元件雙 微體（Double minutes, DMs)及染色體上的異常結(jié)構(gòu)均質(zhì)染色區(qū)（Homogeneous staining regions, HSRs)。1962年，人們首次在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DMs。DMs是染色體外成對環(huán)狀，能 自主復(fù)制的染色小體。DMs沒有著絲粒，在細(xì)胞分裂中隨機(jī)分配，正因?yàn)槿绱?，DMs隨時(shí)面臨 著丟失的風(fēng)險(xiǎn)。但是，DMs本身帶有的擴(kuò)增基因或者與耐藥相關(guān)的基因能為細(xì)胞本身提供 生長優(yōu)勢，因此在群體中會出現(xiàn)DMs逐漸增多的現(xiàn)象。人們最早在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 及耐MTX的中國倉鼠細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了均質(zhì)染色區(qū)。應(yīng)用G顯帶技術(shù)發(fā)現(xiàn)一段缺乏典型帶紋 的染色體片段，并稱其為均質(zhì)染色區(qū)或異常顯帶區(qū)域。
[0005] 研宄發(fā)現(xiàn)，包含DHFR耐藥基因的DMs數(shù)量減少會逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對MTX的耐藥情況。而 目前DMs減少的機(jī)制還不十分明確。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測使DMs 數(shù)量減少的原因主要有以下兩種：第一，DMs轉(zhuǎn)化為HSRs ;第二，DMs以微核形式外排。目前 研宄表明，微核外排具有典型的細(xì)胞周期依賴性，主要發(fā)生在Gtl期和M期。因此，細(xì)胞周期 進(jìn)程加快可能導(dǎo)致微核外排量增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DMs數(shù)量的減少。
[0006] 基因擴(kuò)增產(chǎn)生的前提條件是DNA雙鏈斷裂（double strands break，DSB)的發(fā)生。 在此基礎(chǔ)上，細(xì)胞對于DSB的修復(fù)能力異常增加。DSB修復(fù)主要存在兩種機(jī)制，同源重組修 復(fù)（homologous recombination repair，HR)是其中較為精確的修復(fù)機(jī)制。因此，HR的異 常表達(dá)可能會影響腫瘤細(xì)胞中基因擴(kuò)增的程度。
[0007] HR的主要參與蛋白包括：PI3K家族成員ATM、剪切酶復(fù)合體MRN(MRE11/RAD50/ NBSl)、BRCA1、BRCA2、RAD51 及其類似物家族、RAD52、RAD54、RecQ 解旋酶等。其中，BRCAl 是重要的核心分子之一。研宄發(fā)現(xiàn)，BRCAl不僅可競爭性抑制53BP1，啟動HR ;它還能與MRN 復(fù)合體相結(jié)合完成DNA末端的剪切；促進(jìn)RAD51的募集以保證鏈入侵的順利進(jìn)行；此外，它 還能夠影響細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。本研宄針對BRCAl進(jìn)行干擾后 發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)DSB累積急劇增加；研宄還發(fā)現(xiàn)，干擾BRCAl能夠加快細(xì)胞周期進(jìn)程，使含有 DHFR擴(kuò)增基因的微核外排增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DHFR基因劑量減少，細(xì)胞對MTX的耐藥能力降 低，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥情況，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)，為有效地對抗MTX耐藥提供 科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對腫瘤治療藥物MTX在治療過程中常常產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致化療失敗甚至疾病復(fù) 發(fā)的現(xiàn)象，本發(fā)明提供了 BRCAl蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用，具 體涉及BRCAl蛋白在制備通過下調(diào)DHFR基因擴(kuò)增進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對MTX耐藥性的藥物 中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述腫瘤細(xì)胞為對MTX的耐受程度為l(T4mol/LMTX的人結(jié)腸癌 細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案是構(gòu)建人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29MTX耐藥的進(jìn)化模型，檢測BRCAl 在腫瘤細(xì)胞耐藥過程中是否發(fā)揮作用，然后，將BRCAlshRNA和Control shRNA分別轉(zhuǎn)入含 DMs的耐藥細(xì)胞中，獲得穩(wěn)定克隆，應(yīng)用MTT，IC5tl分析，流式細(xì)胞術(shù)，Real-time PCR，F(xiàn)ISH， Western Blot等技術(shù)方法，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的生長、耐藥、周期、DSB、DSB修復(fù)通路功能和 擴(kuò)增基因外排等情況，明確BRCAl是否通過參與同源重組修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控維持基因擴(kuò) 增，參與細(xì)胞耐藥。抑制BRCAl后可否外排細(xì)胞中的耐藥擴(kuò)增基因，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。
[0011] 我們通過穩(wěn)定干擾BRCAl，阻斷HR修復(fù)途徑也同時(shí)影響了細(xì)胞周期，以探宄BRCAl 與基因擴(kuò)增之間的關(guān)系。從而為揭示新的治療靶點(diǎn)、更加有效對抗MTX耐藥提供科學(xué)的依 據(jù)。
[0012] 1.細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建進(jìn)化模型
[0013] 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29在含有15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于5% C02、 37°C條件下，用濃度梯度遞增的MTX連續(xù)培養(yǎng)，篩選出一系列HT29MTX耐藥細(xì)胞，并根據(jù) 其對 MTX 的耐受程度命名為 HT291(T7mol/L MTX，HT291(T6mol/L MTX，HT291(T5mol/L MTX， HT291(T4mol/L MTX。將HT29MTX敏感細(xì)胞命名為HT29MTX S。待每個濃度梯度細(xì)胞對相應(yīng) 藥物濃度耐受后，繼續(xù)培養(yǎng)5個月直至其穩(wěn)定耐藥，然后再用其做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0014] 2. HT29MTX敏感及耐藥細(xì)胞中DHFR基因擴(kuò)增程度及擴(kuò)增形式的變化
[0015] (1)應(yīng)用QIAmp DNA mini kit試劑盒并按照說明書提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行所需細(xì)胞 系基因組DNA的提取，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測HT29MTX敏感及耐藥細(xì)胞中DHFR基因 的擴(kuò)增程度。與HT29MTX敏感細(xì)胞相比，HT29MTX耐藥細(xì)胞中DHFR基因擴(kuò)增程度隨著MTX 耐藥濃度升高而增加。
[0016] (2)細(xì)胞中期核型標(biāo)本制備，F(xiàn)ISH檢測DHFR基因擴(kuò)增形式的變化
[0017] 與HT29MTX敏感細(xì)胞相比，基因擴(kuò)增的形式由HSRs逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐訢Ms為主的方 式，尤其當(dāng)耐藥濃度達(dá)到l〇_4mol/L時(shí)，細(xì)胞系中出現(xiàn)以DMs為主的基因擴(kuò)增形式。因此， 我們選取HT2910_4mol/L MTX耐藥細(xì)胞作為含DMs的耐藥細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研宄，并命名為 HT29MTX DMs0
[0018] 3. HT29MTX敏感及耐藥細(xì)胞中DHFR蛋白表達(dá)水平的變化
[0019] 提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western Blotting方法檢測HT29MTX敏感及耐藥細(xì)胞中 DHFR蛋白表達(dá)水平。與HT29MTX敏感細(xì)胞相比，HT29MTX耐藥細(xì)胞中DHFR蛋白表達(dá)水平隨 著MTX耐藥濃度升高而增加。
[0020] 4. BRCAl 表達(dá)分析
[0021] 提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western Blotting方法檢測BRCAl在HT29MTX敏感及含 DMs的耐藥細(xì)胞中的表達(dá)變化。與HT29MTX敏感細(xì)胞相比，含DMs的耐藥細(xì)胞中BRCAl過表 達(dá)。
[0022] 5. HT29含DMs的MTX耐藥細(xì)胞穩(wěn)定干擾BRCAl克隆的建立
[0023] 確定HT29含DMs的MTX耐藥細(xì)胞對嘌呤霉素的敏感性，選擇適當(dāng)?shù)泥堰拭顾貪舛?作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)的藥物篩選濃度。將處于對數(shù)生長期的HT29含DMs的MTX耐藥細(xì)胞接種 于6孔板中，每孔細(xì)胞3X IO5個。待細(xì)胞長至80%時(shí)，進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分兩組進(jìn) 行：第一組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒BRCAlshRNA ;第二組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Control shRNA。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入適 當(dāng)濃度的嘌呤霉素。在培養(yǎng)過程中，大部分細(xì)胞皺縮死亡，只有少數(shù)細(xì)胞存活，換液，繼續(xù)培 養(yǎng)。最后，存活細(xì)胞開始增殖并逐漸形成單克隆。當(dāng)形成的克隆達(dá)到肉眼可見大小的時(shí)候， 進(jìn)行克隆挑取。HT29含DMs的耐藥細(xì)胞對照組克隆命名為sh-control，干擾組克隆命名為 sh-BRCAlo
[0024] 6.檢測BRCAl蛋白質(zhì)表達(dá)情況鑒定穩(wěn)定干擾克隆的干擾效果
[0025] 對細(xì)胞進(jìn)行饑餓同步化處理后提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western Blotting方法檢測 BRCAl在HT29含DMs的MTX耐藥細(xì)胞的對照克隆及干擾BRCAl的克隆中的表達(dá)情況。經(jīng)檢 測，干擾克隆中BRCAl的表達(dá)量明顯低于對照克隆中的表達(dá)量，證明所挑選的克隆為有效 克隆。
[0026] 7.穩(wěn)定干擾BRCAl對DSB的產(chǎn)生及細(xì)胞功能的影響
[0027] (1)應(yīng)用Western Blot檢測穩(wěn)定干擾BRCAl前后細(xì)胞中γΗ2ΑΧ的表達(dá)量，以確定 干擾BRCAl對DSB產(chǎn)生的影響。在ΗΤ29含DMs的耐藥細(xì)胞中，穩(wěn)定干擾BRCAl后，細(xì)胞內(nèi) γΗ2ΑΧ的表達(dá)量明顯增加。即干擾BRCAl后細(xì)胞內(nèi)的DSB大量累