UBC和Actin1作為水稻黑條矮縮病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明運(yùn)用geNorm和NormFinder軟件鑒定了感水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)植株中焚光定量PCR的內(nèi)參基因組合，UBC和Actinl 作為RBSDV侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因，明顯優(yōu)于單個內(nèi)參基因的校正效果， 可應(yīng)用于RBSDV侵染植株基因功能研宄，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 水稻黑條矮縮病，病原為水稻黑條矮縮病毒，是一種由灰飛虱以持久性不經(jīng)卵方 式傳播的惡性病毒病。感染RBSDV水稻病株大都不能抽穗，減產(chǎn)嚴(yán)重，除水稻外，還危害小 麥、玉米、大麥及高粱等作物。20世紀(jì)60、90年代后期該病害在華北、華東等地暴發(fā)成災(zāi)，近 年來，感病品種的廣泛種植及稻麥輪作方式的推廣和冬季氣候變暖等環(huán)境條件的變化使傳 毒介體灰飛虱的發(fā)生量不斷上升，導(dǎo)致該病害在華東稻區(qū)大面積發(fā)生。迄今為止，幾乎沒有 能有效防治病毒病的化學(xué)藥劑，治蟲防病的應(yīng)急措施無法作為一項(xiàng)長期策略，而研宄寄主 在病毒侵染后基因的功能進(jìn)而病害防控中加以利用則是一種更為環(huán)保的手段。要獲得準(zhǔn)確 和可靠的基因表達(dá)結(jié)果首先需要有用于數(shù)據(jù)校正的內(nèi)參基因，也有利于不同研宄間數(shù)據(jù)的 借鑒與比較。用于校正和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因必需在任何條件下是持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)，否則 就會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果，現(xiàn)有的研宄多以THMl-Like等單個基因作為內(nèi)參基因，其在不同處 理時可能會有穩(wěn)定性問題，有必要盡快確立一種合適的內(nèi)參基因體系以解決這一問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明針對上述研宄背景，以接種水稻黑條矮縮病毒的日本晴水稻為材料對常用 的內(nèi)參基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)UBC和Actinl是表達(dá)最穩(wěn)定的基因，以這兩個基因作為RBSDV 侵染后水稻中基因功能分析的內(nèi)參基因組合，明顯優(yōu)于單個內(nèi)參基因的校正效果。
[0004] 本發(fā)明所提供的水稻黑條矮縮病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因組合， 是通過以下方法獲得的：
[0005] 1)用熒光定量PCR的方法，對接種水稻黑條矮縮病毒的日本晴水稻以14對水稻中 常用內(nèi)參基因的表達(dá)及其相關(guān)引物的特異性進(jìn)行評估；
[0006] 2)運(yùn)用geNorm程序評估候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性；
[0007] 3)通過NormFinder軟件驗(yàn)證geNorm程序的運(yùn)算結(jié)果；
[0008] 4)依據(jù)geNorm程序可以計(jì)算引入一個新內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異V值， 其默認(rèn)閾值為0.15。根據(jù)Vn/n+Ι比值可以判斷引入一個新內(nèi)參基因是否會對標(biāo)準(zhǔn)化因子 產(chǎn)生顯著影響，如果Vn/n+Ι大于0. 15,則需要再引入第n+1個內(nèi)參基因；如果Vn/n+Ι小于 0. 15,則不必再引入新的內(nèi)參基因；
[0009] 5) RBSDV侵染條件下熒光定量PCR多內(nèi)參和單內(nèi)參校正的數(shù)據(jù)分析比較，驗(yàn)證多 內(nèi)參基因的組合是否優(yōu)于單內(nèi)參基因。
[0010] 在RBSDV侵染的條件下鑒定的用于校正熒光定量PCR最合適的內(nèi)參基因 UBC和 Actinl的應(yīng)用范圍包括：RBSDV侵染植物中病毒的定量；RBSDV侵染植株中相關(guān)基因的表達(dá) 分析以及RBSDV侵染植株模式的研宄。
[0011] 本發(fā)明能為在RBSDV侵染植株中獲得準(zhǔn)確和可靠的基因表達(dá)結(jié)果提供理論依據(jù)， 其結(jié)果可以用于研宄RBSDV侵染植株基因功能。
【附圖說明】：
[0012] 圖1熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性分析。㈧候選內(nèi)參基因的溶解曲線圖，實(shí)驗(yàn)有三 次生物學(xué)重復(fù)，溶解曲線呈單峰；(B)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測候選內(nèi)參基因擴(kuò)增的特性條 帶；(C) 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量；
[0013] 圖2候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平分析。㈧14個候選內(nèi)參基因的平均Ct值；(B)比 較RBSDV侵染植株與對照（不侵染）植株中14個候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平，注：Ct values : Ct值；
[0014] 圖3RBSDV侵染條件下熒光定量PCR內(nèi)參基因的geNorm分析，注：Average expression stability values (M):內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性平均值（M)，pairwise variation (V):配對差異值（V);
[0015] 圖4RBSDV侵染條件下熒光定量PCR內(nèi)參基因的NormFinder分析，注：Average expression stability values (M):內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性平均值（M);
[0016] 圖5RBSDV侵染條件下OsPRlb和OsWRKY基因表達(dá)在多內(nèi)參或單內(nèi)參條件下的數(shù) 據(jù)分析比較，注：Relative expression levels:相對表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】：
[0017] 下面實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0018] 實(shí)施例1，RBSDV侵染植株中基因功能分析內(nèi)參基因組合的獲得
[0019] 1、植物材料、病毒分析以及侵染方法
[0020] 水稻種子（日本晴）首先用0. 1% HgC12消毒1小時；然后用去離子水沖洗干凈， 25°C浸種一天，催芽一天；催芽后的種子用木村B培養(yǎng)液中培養(yǎng)，光照14小時，黑暗10小 時，溫度28±1°C。
[0021] 于江蘇鹽城、徐州、連云港等水稻黑條矮縮病重病區(qū)采集表現(xiàn)RBSDV癥狀（浙江農(nóng) 業(yè)科學(xué)，1984,（4) :185-192.)的水稻病株，通過RT-PCR方法（江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009, 25(6): 1263-1267)檢測病株是否攜帶RBSDV，利用水稻條紋葉枯病毒（RSV)外殼蛋白基因?qū)?yīng)的 引物（CP-F :ATGGGTACCAACAAGCC，CP-R :CTAGTCATCTGCACCTT)檢測病株，選取不攜帶 RSV 的 RBSDV病株作為毒源。將1-2齡無毒灰飛虱若蟲在毒源上飼毒2-3d，而后移入育有武育粳3 號秧苗的燒杯中飼養(yǎng)使其度過循回期，12-13d后從每杯中隨機(jī)取出30頭經(jīng)DIBA方法（南 京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012,杜琳琳）測定其帶毒率，用于測算有效接種蟲量[有效接種蟲 量（蟲）=接種蟲量（蟲）X帶毒率（％ )]。
[0022] 14天大小的幼苗每棵接種10頭有病毒的灰飛虱；接毒3天后，移除灰飛虱，將 幼苗移栽到大田中；取接病毒后7、14、21天的水稻葉片保存在-80°C冰箱中做后續(xù)研宄 (RT-PCR方法確認(rèn)侵染是否成功）。
[0023] 2、RNA 提取
[0024] 總RNA按照說明書用Trizol提取，并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測濃度和質(zhì) 量。只有260/280的比值在1. 9和2. 1之間且260/230的比值大于2. 0的RNA可以用作后 續(xù)的實(shí)驗(yàn)。RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有的樣品都標(biāo)準(zhǔn)化到同一濃度，用于后 續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0025] 3、反轉(zhuǎn)錄和熒光