白假絲酵母菌的lamp檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，屬于真菌品種的檢測(cè)方法，具體的說(shuō)是涉及白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著人類環(huán)境、疾病等方面的改變，真菌類感染的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。假絲酵母屬(Candida Berkhout)是酵母菌中最大的一個(gè)屬，包括163個(gè)種，約占目前已知酵母菌種數(shù)的1/3 ;白假絲酵母菌亦稱白色念珠菌，是導(dǎo)致真菌感染的重要致病菌之一。白假絲酵母菌廣泛分布于自然界，以及正常人體的皮膚、口腔、腸道、肛門、陰道等處，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病，為條件致病菌。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低或菌群失調(diào)時(shí)，白假絲酵母菌就會(huì)繁殖并改變生長(zhǎng)形式侵入人體細(xì)胞從而引起疾病。隨著獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤等疾病發(fā)病率的上升，以及免疫抑制劑、抗生素及侵入性治療的廣泛應(yīng)用，使白假絲酵母菌成為常見(jiàn)的感染病原菌。
[0003]白假絲酵母菌細(xì)胞呈卵圓形，致病性菌株細(xì)胞呈現(xiàn)假菌絲。該菌在血瓊脂或沙保氏瓊脂上，以37°C或室溫孵育2?3d后，生成灰白乳酪樣菌落；涂片鏡檢，可看到表層為卵圓形芽生細(xì)胞，底層有較多假菌絲。若接種于4%玉蜀黍瓊脂上，室溫孵育3?5d可見(jiàn)假菌絲，芽生孢子，厚膜孢子。白假絲酵母菌對(duì)熱的抵抗力不強(qiáng)，加熱至60°C，lh后即可死亡。但對(duì)干燥、日光、紫外線及化學(xué)制劑等抵抗力較強(qiáng)。
[0004]白假絲酵母菌引起淺表性感染和深部感染，引起的相關(guān)疾病有皮膚念珠菌病，包括指趾間糜爛，多見(jiàn)于長(zhǎng)期從事潮濕作業(yè)的人、念珠菌性間擦瘆多見(jiàn)于小兒和肥胖多汗者、丘瘆形念珠菌病多見(jiàn)于肥胖兒童、念珠菌性甲溝炎、甲床炎等多見(jiàn)于指甲；粘膜念珠菌病，多見(jiàn)于嬰幼兒患者的鵝口瘡以及生殖器念珠菌?。欢畈扛腥炯膊t包括內(nèi)臟念珠菌病，該感染可累及全身所有內(nèi)臟器官，其中以腸念珠菌病及肺念珠菌病較常見(jiàn)。此外還可引起泌尿道炎、腎孟腎炎、心內(nèi)膜炎及腦膜炎等，偶見(jiàn)其引發(fā)念珠菌性敗血癥。念珠菌瘆，即念珠菌及其代謝產(chǎn)物引起的皮膚變態(tài)反應(yīng)，主要損害為成群的無(wú)菌性水皰，多見(jiàn)于手指間；也可見(jiàn)到銀肩病樣、玫瑰糠瘆樣、脂溢性皮炎樣、蕁麻瘆樣、離心性環(huán)狀紅斑樣損害。
[0005]由此可見(jiàn)，開(kāi)展白假絲酵母菌快速檢測(cè)方法的研宄具有十分重要的意義。目前有關(guān)白假絲酵母菌快速檢測(cè)的方法主要分為2種:
I)以微生物培養(yǎng)為主的傳統(tǒng)檢測(cè)方法。首先增菌培養(yǎng)，取供試液1ml直接或處理后接種至適量的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48?72h。然后取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24?48h，必要時(shí)延長(zhǎng)至72h，根據(jù)菌落形態(tài)初步判定。
[0006]2)以定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法為基礎(chǔ)的分析法。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶的作用，在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的片段，微量、特定的目的DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬(wàn)倍，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后很容易觀察鑒別，具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]然而，上述2種檢測(cè)方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)體系和操作過(guò)程比較復(fù)雜，難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題，且需要專業(yè)人員操作；PCR儀價(jià)格在5萬(wàn)元左右，擴(kuò)增需要2?3小時(shí)，電泳檢測(cè)需要I小時(shí)左右；電泳常用染料EB為強(qiáng)致癌物質(zhì)，有較強(qiáng)毒性。因此，在科學(xué)研宄和生產(chǎn)實(shí)踐中均需要一種快速簡(jiǎn)便、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的檢測(cè)方法。
[0008]環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n，以下簡(jiǎn)稱LAMP法)是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社于2000年前后開(kāi)發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，可是目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速檢測(cè)白假絲酵母菌的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒以及一種基于上述檢測(cè)引物組和檢測(cè)試劑盒的白假絲酵母菌的恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)方法。
[0010]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)引物組，其包括外引物I和外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:TAAGTATTTGGGAGAAGGGA (SEQ ID No:1)；
外引物 2:AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA (SEQ ID No:2)；
內(nèi)引物 1:CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA (SEQ ID No:3);內(nèi)引物 2:GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG (SEQ ID No:4)。
[0011]一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其包括以下成分:
(1)引物液:含有權(quán)利要求1所述的白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)引物組，所述引物液中各引物的濃度分別為48?52 μ M外引物1、48?52 μ M外引物2，48?52 μ M內(nèi)引物1、48?52 μM內(nèi)引物2 ；
(2)反應(yīng)液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反應(yīng)緩沖液、150mMMgSO4水溶液，所述dNTP、反應(yīng)緩沖液和MgSO4水溶液的體積比是7?9:4?6:2 ;
(3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的濃度為7?9U/ μ I ;
(4)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照為白假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案:引物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M內(nèi)引物1、50 μ M內(nèi)引物2。DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，Bst DNA翁合靡的濃度為8U/ μ I ο 反應(yīng)液中 12mM dNTP: 10 X Isothermal Amplificat1n 反應(yīng)緩沖液:150mM MgSO4水溶液的體積比為8:5:2。
[0013]一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)白假絲酵母菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用煮沸法提取白假絲酵母菌純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8 μ 1，反應(yīng)液15.2μ1，DNA聚合酶 I μ 1，待檢DNA I ?6μ1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 補(bǔ)齊到 25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用白假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min ；
3)結(jié)果判斷:通過(guò)觀察PCR管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:檢測(cè)試劑盒還含有顯色劑，顯色劑為熒光染料Calcein0
[0015]一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)白假絲酵母菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用煮沸法提取白假絲酵母菌純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ I PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8 μ 1，反應(yīng)液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待檢 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用白假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min ；
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入I?2μI顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0016]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:檢測(cè)試劑盒還含有熒光指示劑，熒光指示劑為SYT0-9。
[0017]一種白假絲酵母菌的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)白假絲酵母菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用煮沸法提取白假絲酵母菌純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ I PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8 μ 1，反應(yīng)液15.2μ I,DNA 聚合酶 I μ I，熒光指示劑 SYT0-9 I μ I，待檢 DNA I ?6 μ I，用 DNase/RNase-FreeDistilled Water補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用白假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀(如qPCR儀等)在60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min ；
3)結(jié)果判斷:根據(jù)是否出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]本發(fā)明中采用煮沸法提取白假絲酵母菌純化樣品DNA的方法為:(I)在待測(cè)樣品中加入3倍體積的4%的NaOH或NALC-NaOH ；(2)渦旋振蕩混勻，室溫下放置15 min，然后吸取I ml加入帶旋蓋的離心管中；(3) 12000 rpm離心10 min，去上清液；(4)加入0.9%的NaCl或生理鹽水I ml，混勾，12000 rpm離心10 min，去上清液；(5)加入100 μ I的DNA提取液；(6) 100°C加熱10 min，加熱后迅速冷卻(置于_20°C冰箱)10 min ；(7) 12000 rpm離心2 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。
[0019]dNTP為脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫，是包括dATP，dGTP, dTTP, dCT