七種腹瀉病毒檢測基因芯片的制備和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及七種腹瀉病毒檢測基因芯片的制備和用途，屬于基因芯片檢測技術領 域。
【背景技術】
[0002] 感染性腹瀉是兒童中僅次于呼吸道感染的第二位的多發(fā)病，呈世界性分布，在發(fā) 展中國家5歲以下兒童中尤為突出。感染性腹瀉多見的病原有細菌和病毒。隨著衛(wèi)生條件 的改變和抗生素的使用，細菌性腹瀉在兒童感染性腹瀉中的比例逐步下降，而病毒性腹瀉 所占的比例越來越多。
[0003] 小兒病毒性腹瀉不論是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達國家中都是一個重要的公共衛(wèi) 生健康問題。例如輪狀病毒，有研宄顯示幾乎所有5歲以下兒童都有過輪狀病毒感染。病 毒性腹瀉起病急，發(fā)病率高，病程長，嚴重的可導致死亡。若能在感染早期做出正確的診斷， 使用正確的治療方法，可有效縮短病程和避免其他并發(fā)癥的發(fā)生。因此快速、準確的早期診 斷是控制病毒性腹瀉病的關鍵。傳統(tǒng)的腹瀉病毒檢測方法主要有細胞生物學方法（病毒分 離）、PCR和免疫學診斷。但細胞培養(yǎng)方法分離病毒耗時長，操作復雜；PCR和免疫學方法只 能檢測一種或幾種病原體，不能完全滿足檢測種類多樣的腹瀉病毒的需要。而基因芯片技 術具有快速、準確、低成本等特點適用于腹瀉病毒的高通量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對腹瀉病毒核酸高通量檢測領域存在的一些不足，研制一種 高通量、特異、敏感、快速的腹瀉病毒甄別檢測基因芯片，能同時檢測七種重要的腹瀉病毒， 包括A組輪狀病毒、B組輪狀病毒、I型諾如病毒、II諾如型病毒、星狀病毒、札如病毒、腸道 腺病毒，為腹瀉病毒感染的臨床診斷及流行病學調(diào)查提供一種新的檢測手段。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明七種腹瀉病毒檢測基因芯片，其制備方法如下：
[0006] 1.步驟一：制備腹瀉病毒特異性引物
[0007] 選擇輪狀病毒的VP7基因、諾如病毒的RdRp基因、星狀病毒的ORFI a基因、札如病 毒的RdRp基因、腸道腺病毒的hexon基因等作為檢測靶基因，可以實現(xiàn)七種腹瀉病毒靶基 因片段的擴增。優(yōu)選七對引物序列及其對應的擴增靶標，如表1所示：
[0008] 表1引物序列及對應的擴增靶標
[0009]
[0010] 2.步驟二：制備特異性寡核苷酸探針
[0011] 根據(jù)七種腹瀉病毒基因序列間的比對及每種腹瀉病毒種內(nèi)的序列比對，在上下游 引物范圍內(nèi)的序列相對特異區(qū)進行分型探針的設計。腹瀉病毒特異性探針序列以及對應的 靶標，如表2所示：
[0012] 表2寡核苷酸探針序列及對應的靶標
[0014] 3.步驟三：制備寡核苷酸芯片
[0015] -個優(yōu)選的實施方案，步驟二中的各個寡核苷酸探針在點樣時，用2X點樣液 (6XSSC，0. 1% SDS)稀釋至終濃度50μΜ。用市售的基因芯片點樣儀將探針點到空白的醛 基化修飾玻片上，探針的點樣量均為3nl。寡核苷酸芯片制備完畢后，使用前至少在室溫放 置干燥48小時。該芯片特征在于寡核苷酸探針陣列中同時包括腹瀉病毒12條特異性探 針，其探針陣列如表3所示。其中片基質(zhì)控探針為20Τ序列，5'端bio標記、3'端NH 2修飾， 用來監(jiān)測醛基片片基質(zhì)量；陰性探針為與腹瀉病毒無關的植物基因序列，用來指示特異性； 所有探針的點樣量均為3nl，使用前至少在室溫放置干燥48小時。
[0016] 表3寡核苷酸探針陣列
[0017]
[0018] 4.步驟四：建立多重不對稱PCR體系
[0019] 本發(fā)明基因芯片中PCR體系的特征為2管多重不對稱PCR反應體系。合適的多重 不對稱PCR體系可以進一步提高芯片檢測的靈敏度。對標記引物和非標記引物的絕對濃度 和相對比例、Taq酶的用量等因素進行了優(yōu)化，優(yōu)選的多重PCR體系，如表4所示：
[0020] 表4多重不對稱PCR體系配方
[0022] 優(yōu)選的PCR擴增條件為：50°C逆轉(zhuǎn)錄30min ;94°C預變性3min ;94°C 20s，55°C 20s， 72°C 20s，共 40 個循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0023] 5.步驟五：建立雜交體系
[0024] 合適的雜交體系對芯片的特異性及靈敏度改善也有很大作用。通過優(yōu)化得到了同 時可以保證特異性及靈敏度的雜交液成分、雜交條件和雜交后洗滌條件。在雜交體系中PCR 產(chǎn)物（A管和B管各2. 5 μ 1)與雜交液（5 μ 1)等體積混合，優(yōu)選的雜交液各成分為4 X SSC， 0. 3% SDS，5%甲酰胺，lOXDenhardt。優(yōu)選的雜交條件為45°C水浴雜交1小時。優(yōu)選的洗 滌條件為常溫下洗液A (I X SSC，0. 2 % SDS)，洗液B (0. 2 X SSC)和洗液C (0.1 X SSC)中各洗 洚 20s〇
[0025] 6.步驟六：化學發(fā)光顯色
[0026] 1)在芯片反應區(qū)加入IOyl標記液一一辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素 (str印tavidin-HRP)，37°C水浴放置 30min ;取出后用 PBST 洗液（1XPBS+0.05% Tween20) 清洗20s，重復3次，置室溫晾干。2)將顯色試劑A液和B液等體積混合，每個芯片反應區(qū) 立即避光加入20 μ 1的A、B混合液，將基因芯片放入便攜式化學發(fā)光生物芯片成像儀中成 像，收集的芯片雜交信號使用Array Vision7. 0軟件分析結(jié)果。
[0027] 以上制備的腹瀉病毒甄別檢測基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR體系、雜交液、洗 液A、洗液B、洗液C、標記液、顯色液A、顯色液B。
[0028] -個優(yōu)選的實施方案使用市售的DNA/RNA提取試劑盒（磁珠法）提取腹瀉病毒核 酸，提取參照相應的試劑盒說明書進行。提取的DNA/RNA溶液使用多重PCR體系按照步驟 四中的擴增條件進行擴增。PCR產(chǎn)物與雜交液等體積混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步驟 五和步驟六的條件進行雜交和顯色。
[0029] 洗滌后的芯片使用便攜式化學發(fā)光生物芯片成像儀進行成像，并運用分析軟件判 讀結(jié)果。選擇脊髓灰質(zhì)炎病毒1型、脊髓灰質(zhì)炎病毒2型、柯薩奇病毒A16、?？刹《尽⒛c 道病毒71型、甲型肝炎病毒、腺病毒55型、腺病毒1型、腺病毒3型、腸道病毒70型等病 毒作為樣本，利用上述制備的基因芯片進行檢測，考察芯片的特異性。制備體外轉(zhuǎn)錄RNA 和質(zhì)粒DNA靈敏度參考品，考察芯片的最低檢測限。結(jié)果：七種腹瀉病毒的檢測限均為 3X1000copies/反應。
[0030] 使用本發(fā)明制備的基因芯片檢測腹瀉病毒樣本（糞便）。本芯片法檢測腹瀉病毒 樣本，直接從糞便樣本中提取腹瀉病毒核酸，與測序結(jié)果一致，經(jīng)多重不對稱RT-PCR擴增 后與基因芯片雜交，結(jié)果顯示，樣本基因芯片檢測符合率達到100%。表明本實驗所建立的 基因芯片方法可以對糞便中的腹瀉病毒進行準確檢測。
[0031] 本發(fā)明建立了一種基于化學發(fā)光成像法的基因芯片，可同時甄別七種重要的腹瀉 病毒，包括A組輪狀病毒、B組輪狀病毒、I型諾如病毒、II型諾如病毒、星狀病毒、札如病 毒、腸道腺病毒。該基因芯片具有快速、準確、高通量、特異性高的優(yōu)勢，可為腹瀉病毒感染 的臨床診斷及流行病學調(diào)查提供一種新的檢測手段。性能考察表明，本發(fā)明的基因芯片以 對七種不同的腹瀉病毒進行準確甄別，特異性良好。本發(fā)明芯片對七種腹瀉病毒的檢測靈 敏度為3000copies/反應。
【附圖說明】
[0032] 圖I :為本發(fā)明七種腹瀉病毒檢測基因芯片的陣列示意圖，每張芯片上分布有10 個相同陣列。
[0033] 圖2 :七種腹瀉病毒檢測基因芯片上每個陣列上具體排列布局。圖中一個原點代 表探針的一次點樣，垂直方向的3個圓點為一條探針的3次重復點樣。1號對應的是片基質(zhì) 控探針；2號對應的是陽性對照探針；3號對應的是輪狀病毒A組特異性探針；4號對應的是 輪狀病毒B組特異性探針1 ;5號對應的是輪狀病毒B組特異性探針2 ;6號對應的是I型諾 如病毒特異性探針1 ;7號對應的是I型諾如病毒特異性探針2 ;8號對應的是II型諾如病 毒特異性探針1 ;9號對應的是II型諾如病毒特異性探針2 ;10號對應的星狀病毒探針1 ; 11號對應的是星狀病毒探針2 ;12號對應的是札如病毒探針1 ;13號對應的是札如病毒探 針2 ;14號對應的是腸道腺病毒探針；15號對應的是內(nèi)標探針1 ;16號對應的是內(nèi)標探針2。
[0034] 圖3 :七種腹瀉病毒的芯片檢測圖。其中1-7依次為A組輪狀病毒、B組輪狀病毒、 I型諾如病毒、II型諾如病毒、星狀病毒、札如病毒、腸道腺病毒七種腹瀉病毒檢測芯片檢 測結(jié)果。
[0035] 圖4 :基因芯片特異性檢測結(jié)果圖。其中1-10依次為脊髓灰質(zhì)炎病毒1型、脊髓 灰質(zhì)炎病毒2型、柯薩奇病毒A16、?？刹《?、腸道病毒71型、甲型肝炎病毒、腺病毒55型、 腺病毒1型、腺病毒3型、腸道病毒70型的檢測結(jié)果圖。
[0036] 圖5 :七種腹瀉病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA和質(zhì)粒DNA參考品的靈敏度檢測結(jié)果圖。其 中 1_6 依次為 A 組輪狀病毒 3X 105copies、3X 104copies、3X 103copies、3X 102copies、 3 X IO1Copies體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品和陰性對照檢測結(jié)果；7-12依次為B組輪狀病毒 3X10 5copies、3X104copies、3X103copies、3X Io2CopiesdxiO1Copies 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 參考品和陰性對照檢測結(jié)果；13-18依次為I型諾如病毒3X105copies、3X104copies、 Sxio3Copiesdxio2CopiesdxiO1Copies體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品和陰性對照檢測結(jié)果； 19-24 依次為 II 型諾如病毒 3X IO5Cop ies、3 X IO4Cop ies、3 X IO3Cop ies、3 X IO2Cop ies、 3 X IO1Copies體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品和陰性對照檢測結(jié)果；25-30依次為星狀病毒 3X105copies、3X10 4copies、3X103copies、3X Io2CopiesdxiO1Copies 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 參考品和陰性對照檢測結(jié)果；31-36依次為札如病毒3X 105copies、3X 104copies、 Sxio3Copiesdxio2CopiesdxiO1Copies體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品和陰性對照檢測結(jié)果； 37-42 依次為腸道腺病毒 3X105copies、3X104copies、3X103copies、3X10 2copies、 3X IO1Copies質(zhì)粒DNA參考品和陰性對照檢測結(jié)果。
[0037] 圖6 :七種腹瀉病毒檢測基因芯片樣本檢測結(jié)果圖。IA組輪狀病毒樣本檢測結(jié)果； 2為B組輪狀病毒樣本檢測結(jié)果；3為I型諾如病毒樣本檢測結(jié)果；4為II型諾如病毒樣本 檢測結(jié)果；5為星狀病毒樣本檢測結(jié)果；6為札如病毒樣本檢測結(jié)果；7為腸道腺病毒樣本 檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038] 下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0039] 實施例1 :腹