一種用于快速鑒定2型登革熱病毒的rt-lamp試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病原微生物的檢測(cè)與鑒定，具體涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù) (LAMP技術(shù)）快速鑒定2型登革熱病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 登革熱病毒（Dengue virus，DENV)是一種黃病毒類RNA病毒，主要包括1~ 4型病毒（DENV 1~4)。登革熱病毒主要通過埃及伊蚊Ueofes 和白紋伊蚊 (Jeofe1S a從傳播，登革熱病毒的感染可以引起登革熱（dengue fever，DF)，嚴(yán)重 的還可導(dǎo)致登革出血熱（Dengue hemorrhagic fever，DHF)或登革休克綜合征（Dengue shocksyndrome，DSS)等。DENV廣泛流行于全球的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布于廣 東、海南、廣西、福建、臺(tái)灣等?。ㄗ灾螀^(qū)）。DENV-2型1985-1986年在海南島開始流行，隨 后波及廣州和廣西北海，一直流行至1988年，1993、1998年廣東發(fā)生流行，尋找一個(gè)合適 的DENV-2鑒定方法可以為臨床治療提供很好的基礎(chǔ)。
[0003] 目前登革熱病毒的鑒定方法主要為PCR，ELISA、免疫膠體金等方法。登革熱檢測(cè) 常用的ELISA、免疫膠體金方法耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要5~7 d血清中才能達(dá)到抗體能夠檢測(cè)水 平，同時(shí)登革熱抗體與其他黃病毒存在交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性率較高，故血清學(xué)檢測(cè)作為登 革熱病毒檢測(cè)局限性較大；DENV的分離可以很好的鑒定登革熱病毒，但同樣耗時(shí)長(zhǎng)，敏感 度又很低，也不可以作為早期檢測(cè)登革熱病毒的手段。近10多年發(fā)展起來的DENV核酸檢 測(cè)技術(shù)，為登革熱的早期診斷提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂貴的PCR儀作為基 礎(chǔ)，也在一定程度上限制了 PCR方法在鑒定登革熱病毒上的發(fā)展。
[0004] 以上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的價(jià)值，但因耗時(shí)長(zhǎng)、繁瑣的操作過程、 靈敏度低、需要昂貴的儀器設(shè)備等不同的原因未能在臨床上大規(guī)模推廣使用。環(huán)介導(dǎo)等溫 基因擴(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下簡(jiǎn)稱LAMP法）是日本榮 研化學(xué)株式會(huì)社于2000年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易 普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速鑒定2型登革熱病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速鑒定2型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒、以 及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)（LAMP技術(shù)）快速鑒定2型登革熱病毒的方法。本鑒定 方法方便快捷、價(jià)格低廉，適于推廣應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種用于快速鑒定2型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，包括以下組分：（1)用于快速鑒 定2型登革熱病毒的RT-LAMP特異性引物組；（2)逆轉(zhuǎn)錄酶；（3) DNA聚合酶；（4) RT-LAMP 反應(yīng)液；（5)顯色劑；（6)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；其中，所述用于快速鑒定2型登革熱病毒的 RT-LAMP特異性引物組包括： 內(nèi)引物 1 :5' - GCCATGCGTACAGCTTCCACTGTAGCTCCACCTGAGA-3'（SEQ ID No. 1); 內(nèi)引物 2 :5' - GGGACGTAAAGCCTGGGAGCCTCTAACCACTAGTCTGCTA-3'（SEQ ID No. 2); 外引物 I :5' - GCCATTACAAATGCCATAGC -3'（SEQ ID No. 3); 外引物 2 :5' -CTGCTGCGTTGTGTCATG-3'（SEQ ID No. 4); 環(huán)引物 I :5' - GTTTGTGGCCTCCCAGAT-3'（SEQ ID No. 5); 環(huán)引物 2 :5' - AACCGTGGAAGCTGTACG-3'（SEQ ID No. 6)。
[0007] 所述引物組中，內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物的摩爾比為6~8 :1 :3~4。
[0008] 所述逆轉(zhuǎn)錄酶為轉(zhuǎn)錄酶；所述DNA聚合酶為DNA聚合酶。
[0009] 所述RT-LAMP 反應(yīng)液含有：10 mM dNTP、10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150 mM MgSO4 水溶液、5 mM甜菜堿，四者的體積比為6~8 :4~5 :2~3 :8~10。
[0010] 所述顯示劑為SYBR GREEN I。
[0011] 所述陽(yáng)性對(duì)照為含有2型登革熱病毒NSl基因片段（SEQ ID NO. 7)的質(zhì)粒，陰性 對(duì)照為DEPC水。
[0012] 一種快速鑒定登革熱病毒2型的方法，采用以上所述的試劑盒，加入待檢RNA，在 60~65 °C，等溫?cái)U(kuò)增60~90分鐘，具體包括如下步驟： (1) 提取待檢樣品RNA ; (2) 環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)：25yL反應(yīng)體系中含有：內(nèi)引物1、2各7~9 pmol/^L， 外引物1、2各1~2 pmol/^L，環(huán)引物1、2各3~5 pmol/^L，反應(yīng)液12~13 μL，DNA聚 合酶7~9U，待檢RNA 1~100 ng，逆轉(zhuǎn)錄酶1~2U，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μL，然后加入 18~22PL的密封液，將上述反應(yīng)管于60~65°C反應(yīng)60~90min ; (3) 結(jié)果判斷：在上述反應(yīng)管中加入1-2μL顯色劑10XSYBR GREEN I，混勻后觀察反 應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為登革熱2型病毒，橙色則為非登革熱2型病毒。
[0013] 優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的25 μ L反應(yīng)體系含有：內(nèi)引物1、2各 8pmol/^L，外引物 1、2 各 I pmol/^L，環(huán)引物 1、2 各 4 pmol/^L，反應(yīng)液 12. 5PL，DNA 聚合酶 8U，待檢RNA 1~100 ng，逆轉(zhuǎn)錄酶1U，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μL。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：發(fā)明針對(duì)2型登革熱病毒NSl區(qū)域特異性設(shè)計(jì)了 6條引物， 與目的基因的6個(gè)區(qū)域結(jié)合，具有較高的特異性，能準(zhǔn)確地將2型登革熱病毒和1、3、4型登 革熱病毒以及其他非登革熱病毒區(qū)分開來。另外，本發(fā)明的試劑盒方便快捷，能在較短的時(shí) 間內(nèi)鑒別2型登革熱病毒，不需要昂貴的儀器設(shè)備；靈敏度高；特異性好，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明RT-LAMP試劑盒的陰性與陽(yáng)性對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果（一:陰性對(duì)照，+: 陽(yáng)性對(duì)照）； 圖2為本發(fā)明對(duì)登革熱2型病毒以及對(duì)非登革熱2型病毒的擴(kuò)增結(jié)果（一：陰性樣 品，+ :陽(yáng)性樣品，1 :非2型登革熱病毒樣本，2 :2型登革熱病毒樣品）； 圖 3 為實(shí)施例 3 的特異性驗(yàn)證結(jié)果（1:DEPC，2:HSV，3:EBV，4:JEV，5 :YFV，6:DENV1， 7:DENV2，8:DENV3，9:DENV4); 圖4為實(shí)施例4的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（a :普通PCR擴(kuò)增結(jié)果，b: Real-time PCR擴(kuò)增結(jié) 果，c:本發(fā)明RT-LAMP擴(kuò)增的電泳結(jié)果，d:本發(fā)明RT-LAMP擴(kuò)增的Real-time結(jié)果，e: 本發(fā)明RT-LAMP擴(kuò)增的顯色結(jié)果；其中，1為DEPC，2~7為含有登革熱病毒NS4B基因的 PET-32a 質(zhì)粒，拷貝數(shù)依次為 I. 0、1.0 XlO1U. 0X102、I. 0X103、I. 0X104、1.0 XlO5 拷貝 / μ L)〇
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0017] 實(shí)施例1用于快速鑒定2型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒的建立 用于快速鑒定2型登革熱病毒的RT-LAMP試劑盒，包括以下成分：（1)特異性引物組； (2)逆轉(zhuǎn)錄酶；（3) DNA聚合酶；（4) RT-LAMP反應(yīng)液；（5)顯色劑；（6)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì) 照。
[0018] (1)特異性引物的設(shè)計(jì)： 根據(jù)2型登革熱病毒（GenBank登錄號(hào)為：AF038403)NS4B區(qū)域的的特異性設(shè)計(jì)6條特 異性引物，序列分別如下： 內(nèi)引物 1 :5' - GCCATGCGTACAGCTTCCACTGTAGCTCCACCTGAGA-3'（SEQ ID No. 1); 內(nèi)引物 2 :5' - GGGACGTAAAGCCTGGGAGCCTCTAACCACTAGTCTGCTA-3'（SEQ ID No. 2); 外引物 1 :5' - GCCATTACAAATGCCATAGC -3'（SEQ ID No. 3); 外引物 2 :5' -CTGCTGCGTTGTGTCATG-3'（SEQ ID No. 4); 環(huán)引物 1 :5' - GTTTGTGGCCTCCCAGAT-3'（SEQ ID No. 5); 環(huán)引物 2 :5' - AACCGTGGAAGCTGTACG-3'（SEQ ID No. 6)。
[0019] (2 )逆轉(zhuǎn)錄酶為轉(zhuǎn)錄酶； (3) DNA聚合酶為DNA聚合酶； (4) RT-LAMP反應(yīng)液含有：10mM dNTPUOXThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04、5mM 甜 菜堿，四者的體積比為8 :5 :3 :10。
[0020] (5)顯示劑為 SYBR GREEN I。
[0021] (6)陽(yáng)性對(duì)照為含有2型登革熱病毒NS4B基因片段（SEQ ID NO. 7)的PET-32a質(zhì) 粒(利用常規(guī)的質(zhì)粒構(gòu)建方法將SEQ ID NO. 7插入PET-32a質(zhì)粒中得到）；陰性對(duì)照為DEPC 水。
[0022] 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。
[0023] 實(shí)施例2利用實(shí)施例1的試劑盒快速鑒定2型登革熱病毒