用于現(xiàn)場檢測多種血清型口蹄疫病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴增技術(shù) (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)（Lateral Flow Assay)現(xiàn)場檢測多種血清型口蹄疫病毒的引物、探針及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的發(fā)生在豬、牛、羊等偶蹄類動物上的急性、 熱性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為"A類烈性傳染病"，一旦暴發(fā)，必須撲殺 感染及接觸感染的動物，造成巨大的直接經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及 相關(guān)產(chǎn)品的對外貿(mào)易，對國家的政治、經(jīng)濟具有深遠的影響?？谔阋卟《居?個血清型和65 個以上的血清亞型，血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象，因而難以控制。我國為口蹄疫流行國家， 主要流行〇型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我國大面積爆發(fā)了 Asia 1型口蹄疫，2009 年和2013年爆發(fā)了 A型口蹄疫，近年來，均有0型口蹄疫的散發(fā)和流行，特別是隨著我國養(yǎng) 殖業(yè)集約化、規(guī)?；难该桶l(fā)展，口蹄疫的傳播風(fēng)險也來越大。
[0003] 目前，病毒的分離與鑒定、PCR及其相關(guān)的技術(shù)是口蹄疫病毒檢測的主要方法，口 蹄疫病毒的分離培養(yǎng)要求在生物安全三級以上實驗室進行，并需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè) 的技術(shù)人員，在分尚過程中存在病毒擴散的危險，且耗時長。而PCR及其相關(guān)的技術(shù)可以檢 測口蹄疫病毒的核酸，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，難以滿足非實驗室等現(xiàn)場環(huán)境下的檢測要 求。
[0004] 重組酶等溫擴增（recombinase ploymerase amplification, RPA)技術(shù)是不同于 PCR的核酸檢測技術(shù)，RPA是在重組酶介導(dǎo)下模擬體內(nèi)DNA的復(fù)制過程。重組酶與引物結(jié) 合形成蛋白-DNA復(fù)合物后，尋找到雙鏈DNA同源序列，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下，模板 DNA解鏈，引物與模板DNA配對，并在鏈置換DNA聚合酶的作用下復(fù)制、擴增，單個DNA模板 分子得到大約1〇12擴增產(chǎn)物。它與PCR不同，不需要退火反應(yīng)過程，可在37°C~42°C等溫 條件下，反應(yīng)20余分鐘即可得到擴增產(chǎn)物（Forget et al.，2012)。RPA可以與側(cè)向流動免 疫層析技術(shù)相結(jié)合，在RPA擴增體系中，需要生物素標(biāo)記的反向引物和熒光基團標(biāo)記的探 針，在距熒光基團30個堿基處有一個脫堿基位點（dSpacer)，該位點可被nfo核酶識別、切 害J，產(chǎn)生新的羥基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成帶有生物素和熒光基團雙標(biāo)記的 RPA產(chǎn)物，通過層析膜擴散，被生物素配體和熒光基團標(biāo)記抗體捕獲，形成具有顏色的檢測 線。該方法檢測時間短，5分鐘左右就能目測結(jié)果，肉眼判讀。
[0005] 但目前對于RPA技術(shù)的研宄尚處于起步階段，國內(nèi)外還沒有將RPA技術(shù)應(yīng)用于 FMDV檢測的報道。本發(fā)明系首次采用RPA技術(shù)建立快速檢測FMDV的方法，并通過特異性和 靈敏度評價，可用于臨床現(xiàn)場檢測，為FMDV的現(xiàn)場檢測提供一種靈敏、可靠的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對RPA技術(shù)應(yīng)用于FMDV檢測領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、快速、簡便的 現(xiàn)場檢測口蹄疫病毒的RPA檢測方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0008] 一種用于通過RPA-側(cè)流層析技術(shù)檢測多種血清型口蹄疫病毒的通用引物和探針 組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列 如 SEQ ID No. 3 所示。
[0009] 正向引物 2BF:5' -GTCTCGACGAGGCCAAGCCCTGGTACAAACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物 2BR :5' -【Biotin】CGAGGCGACCTTGACCAACCCGGCCAACAGG-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探針序列 2BP :5'-【FAM】GTCTTGAGATTCTGGACAGCACTTTTGTCGTG【dSpacer】 AAAAGATCTCCGACTCG【C3-spacer】3, ；（SEQ ID Νο·3)。
[0012] 需要說明的是：與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物的長度通常為30-35bp， 探針序列的長度為46-52bp，引物設(shè)計時為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級結(jié)構(gòu)，其長度 的增加也使引物設(shè)計及選擇難度的增加，因此，引物的設(shè)計和選擇對RPA的結(jié)果至關(guān)重要。 RPA技術(shù)正處于起步研宄階段，尚無專門的引物、探針設(shè)計軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引 物設(shè)計原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計多對引 物進行優(yōu)化、篩選才能得到。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測口蹄疫病毒的試劑盒，該試劑盒中包含有由用于通過 RPA技術(shù)檢測口蹄疫病毒的引物和探針組成的引物探針液。
[0014] 所述引物探針液的組成為：正向引物2BF和反向引物2BR終濃度均為0. 4μπιο1/ L，檢測探針2ΒΡ的終濃度為0. 12 μmol/L，擴增核苷酸序列片段為SEQ ID NO. 4所示。
[0015] 進一步的，該檢測口蹄疫病毒的試劑盒中還包括有：標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、緩沖液、酶擴 增八聯(lián)管、無菌雙蒸水、反應(yīng)驅(qū)動液、產(chǎn)物稀釋液和側(cè)流層析試紙條；
[0016] 所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為pEASY-T3_2B，用于檢測的陽性對照，以檢驗反應(yīng)體系和反應(yīng) 條件能否正常反應(yīng)。
[0017] 用于構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的引物序列如下：
[0018] FMDV-F :5, -CACTCCCTTACACCGCTCCC-3,（SEQ ID No:5);
[0019] FMDV-R :5, -ACTCTTTCCCTGGCCGGATT-3'（SEQ ID No:6)。
[0020] 所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-T3-2B是以FMDV基因組cDNA為模板，由SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6PCR擴增的核苷酸序列片段（SEQ ID NO. 7)與PEASY-T3載體相連接后得到的 重組質(zhì)粒，連接方法為所屬領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0021] PCR 擴增的反應(yīng)體系為 50 μ L :10XPCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2. 5mM dNTP M ixture 8 μ L、rTaq 0· 5 μ L (5U/ μ L)、cDNA 模板 2 μ L，10 μ mol/L 的引物 FMDV-F 和 FMDV-R 各2 μ L，滅菌超純水加至50 μ L。
[0022] 反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 3min，然后 94°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，35 個循環(huán)；72°C 延伸5min，4°C保存。
[0023] 所述無菌雙蒸水可作為陰性對照或補足反應(yīng)體系用，其制備方法為雙蒸水經(jīng)高壓 滅菌后，分裝到滅菌的小管中。
[0024] 所述的緩沖液、酶擴增八聯(lián)管、反應(yīng)驅(qū)動液、產(chǎn)物稀釋液可于市場購買得到。
[0025] 具體的，一種檢測口蹄疫病毒的試劑盒，每50yL擴增體系中含有緩沖液 29. 5 μ L、引物探針液4. 6 μ L、無菌雙蒸水12. 4 μ L、待測樣本cDNA或陽性對照分別為1 μ L 或空白對照1 μ L、反應(yīng)驅(qū)動液2. 5 μ L。（上述陽性對照是指陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，空白對照指無菌 雙蒸水）
[0026] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測FMDV的方法，步驟如 下：
[0027] (1)提取待測樣本的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA ;
[0028] (2)設(shè)計用于多種血清型口蹄疫病毒檢測的通用引物和探針，以cDNA為模板，進 行RPA擴增，擴增條件為：38°C水浴4min后，混勻，再38°C水浴20min ;
[0029] (3)應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進行擴增產(chǎn)物檢測，當(dāng)試紙條出現(xiàn)兩條棕色條帶，一條位 于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，一條位于檢測區(qū)，則結(jié)果為陽性，表明樣本中含有口蹄疫病毒核酸；當(dāng)試紙條 只有質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條棕色條帶，檢測區(qū)沒有條帶，則結(jié)果是陰性，表明樣本中不含有口蹄疫 病毒核酸。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] (1)采用本發(fā)明的引物和探針組合，通過RPA技術(shù)對FMDV進行檢測的方法，具有較 高的靈敏度、特異性和重復(fù)性。
[0032] 本發(fā)明選用的口蹄疫病毒2B基因引物是經(jīng)大量實驗篩選獲得的，特異性好，與 牛、豬的其他病毒包括牛腸道病毒、牛流熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳 染性鼻氣管炎病毒、豬皰瘆病毒、豬瘟病毒等病毒無交叉反應(yīng)。
[0033] RPA能夠?qū)⒑哿康暮怂崮０鍞U增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約 IO12擴增產(chǎn)物；本發(fā)明所建立檢測方法可檢測5TCID 5(|的FMDV病毒。
[0034] (2)本發(fā)明的RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測FMDV的方法，既具有分子生物學(xué) 檢測的高靈敏、高通量，又具有免疫學(xué)檢測的特異性好、操作簡便的優(yōu)點，還不需復(fù)雜儀器， 尤適于基層實驗室和現(xiàn)場的口蹄疫病毒快速篩查檢測。
[0035] (3)檢測速度快：與常規(guī)PCR相比，不必經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，RPA反應(yīng)的 最適溫度在37°C -42°C之間，無需變性，在常溫下20min左右即可完成反應(yīng)。
[0036] (4)不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適用于現(xiàn)場檢測。本發(fā)明所建立檢測方法可以在常溫 等溫條件下擴增、試紙條可視化檢測，不要PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、電泳槽等復(fù)雜 的儀器設(shè)備，而且RPA不需復(fù)雜的樣品處理，可以真正實現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場快速核酸檢測。
【附圖說明】
[0037] 圖1為RPA引物、探針組的篩選結(jié)果，其中1為引物2BF、2BR和探針2BP組，2為 引物2CF、2CR和探針2CP1組，3為2CF、2CR和探針2CP2組，4為3AF、3AR和探針3AP組，5 為3CF、3CR和探針3CP組，6為3DF