聚物的5'末端和所述寡聚物的3'末端為BNA單體。
[0175] 所述寡聚物可以甚至具有12-18個(gè)單體或13-17個(gè)單體。
[0176] 優(yōu)選地，更低親和力區(qū)域可與微小RNA的種子序列堿基配對(duì)或可與微小RNA的種 子序列的RNA互補(bǔ)序列堿基配對(duì)。人微小RNA是優(yōu)選的。 實(shí)施例
[0177] 實(shí)施例1
[0178] 在本實(shí)施例中，測(cè)量各種寡聚物對(duì)目標(biāo)靶以及對(duì)脫靶RNA的親和力。最后，測(cè)量寡 聚物對(duì)由共有序列組成的靶RNA的親和力。
[0179] 使用的靶RNA首先是：
[0180] (135-Hcvtarg)5, GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
[0181] 其中共有序列加以下劃線。
[0182] 與該靶RNA互補(bǔ)的寡聚物的序列：
[0183] CUGUGAGGUGGUAC-5,
[0184] 并且當(dāng)彼此結(jié)合時(shí)：
[0185] 靶：5, GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
[0186] I I I I I I I I I I I I I
[0187] HCV 寡聚物 CUGUGAGGUGGUAC5，
[0188] 首先，使用下列寡聚物，其中更低親和力區(qū)域加以下劃線：
[0189] (l23_HCVtm，均勻修飾的）：
[0190] lClAmUmGlGmUlGlGmAlGmUmGlTlC
[0191] (124-HCVtm，與共有序列互補(bǔ)的更低親和力區(qū)域）：
[0192] IciAlTlGlGlTmGmGmAmGmUmGlUlC
[0193] (125-HCV，與共有序列互補(bǔ)的tm更低親和力區(qū)域）：
[0194] IciAlTlGlGmUmGmGmAmGmUmGmUl C
[0195] (126-HCVtm，與共有序列互補(bǔ)的更低親和力區(qū)域）：
[0196] IciAlTlGlGmUmGmGuAmGmUmGmUl C
[0197] (127-HCVtm，與共有序列互補(bǔ)的更低親和力區(qū)域）：
[0198] ICl AmUmG I GmUmGmGmAmGmUmG ITlC
[0199] (128-HCVtm，與共有序列互補(bǔ)的更高親和力區(qū)域）：
[0200] mCmAmUmGmGlTlGlGlAlGlTlGlTmCo
[0201] m 表示 2' 0-甲基 RNA
[0202] 1 表示 LNA (BNA)
[0203] u 表不解鎖核酸（unlocked nucleic acid，UNA)
[0204] 在中等鹽濃度即 IOOmM NaCl，0.1 mM EDTA, IOmM NaH2P04,5mM Na2HP04，pH 7.0) 中，使用1.0 μΜ濃度的寡聚物和互補(bǔ)RNA，以及在低鹽濃度，即在IOmM NaCl而非IOOmM NaCl中測(cè)量解鏈溫度。
[0205] 表 2:
[0206]
[0207] 對(duì)于高鹽中的測(cè)量值，僅126HCVtm顯示具有更低的tm值，這與降低親和力的UNA 單體的存在相符。
[0208] 對(duì)于低鹽中的測(cè)量值，tm值與LNA單體的含量良好相關(guān)，并且再次地看到一個(gè)UNA 單體顯著地降低親和力。
[0209] 接下來(lái)，測(cè)量另一個(gè)寡聚物序列（Aldo A)對(duì)相同靶RNA的親和力。該另一個(gè)寡聚 物與靶RNA的相同共有序列互補(bǔ)，但在所述序列的其余部分有差異：
[0210] 靶：5, GAUGGGGGCGACACUCCACCAUGAAU
[0211] 1IIIIIII
[0212] Aldo 寡聚物： GUUGUGAGGUCCGG
[0213] 1表示潛在的G: U堿基對(duì)。
[0214] 這些測(cè)量中使用的寡聚物是：
[0215] 審低親和力厭域加以下劃線
[0216] (129-Aldo,均勻修飾的）
[0217] lGlGmClCmUlGmGlAmGmUlGmUlTlG
[0218] (130-Aldotm，與共有序列互補(bǔ)的更低親和力區(qū)域）
[0219] IGlGiciClTmGmGmAmGmUmGlTlTlG
[0220] (131-Aldotm，與共有序列互補(bǔ)的更低親和力區(qū)域）
[0221] IGlGiciCmUmGmGmAmGmUmGmUlTlG
[0222] (133-Aldotm，與共有序列互補(bǔ)的更高親和力區(qū)域）
[0223] mGmGmCmClTlGlGlAlGlTlGlTmUmG
[0224] 表 3:
[0225]
[0226] 在該組測(cè)量值中，HCV靶可被看作與寡聚物的目標(biāo)靶共享共有靶的脫靶。再次地， 解鏈溫度與LNA的含量總體上相關(guān)。此外，可看到當(dāng)互補(bǔ)區(qū)中LNA的含量增加時(shí)，親和力增 加。當(dāng)非互補(bǔ)區(qū)中LNA密度更高時(shí)，解鏈溫度降低，參見(jiàn)寡聚物131。
[0227] 接下來(lái)，測(cè)量寡聚物對(duì)互補(bǔ)的8個(gè)核苷酸共有RNA的親和力。寡聚物對(duì)該8個(gè)核 苷酸的共有RNA的親和力可被看作是所述寡核苷酸對(duì)包含所述共有序列、但在和所述共有 序列相鄰的區(qū)域中不與所述寡聚物互補(bǔ)的脫靶的親和力的測(cè)量。
[0228] 共有 RNA 是：
[0229] 5, ACACUCCA
[0230] 表 4:
[0231]
[0232] 如所看到的，更少的脫靶結(jié)合（更具特異性的寡聚物）可通過(guò)降低互補(bǔ)區(qū)域中的 LNA含量來(lái)設(shè)計(jì)。
[0233] 如果將相同設(shè)計(jì)原理用于設(shè)計(jì)針對(duì)包含共有序列的其它靶序列的反義寡聚物，通 ?？蓪?shí)現(xiàn)增強(qiáng)的特異性。
[0234] 因此，本發(fā)明的教導(dǎo)，包括上述實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)具有一般適用性而不限定于某 些序列/靶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種結(jié)合RNA的10-20個(gè)單體的寡聚物，其由如下區(qū)域組成： ?包含至少25%的BNA單體的更高親和力區(qū)域， ? 6-10個(gè)連續(xù)單體的更低親和力區(qū)域，其包含少于25 %的BNA單體，并且其中所述更 低親和力區(qū)域的5'末端處的2個(gè)單體和所述更低親和力區(qū)域的3'末端處的2個(gè)單體是非 BNA單體， ?以及其中所述寡聚物不包含5個(gè)連續(xù)DNA單體的區(qū)域。2. 權(quán)利要求1的寡聚物，其中所述更高親和力區(qū)域中BNA單體的密度為所述更低親和 力區(qū)域中BNA單體的密度的至少3倍。3. 權(quán)利要求1的寡聚物，其中所述更低親和力區(qū)域不包含任何BNA單體。4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述更高親和力區(qū)域包含至少50%的BNA單 體。5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其中至少一個(gè)核苷酸間連鍵是硫代磷酸酯連鍵。6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述更低親和力區(qū)域由8-10個(gè)連續(xù)單體組 成，并且其中所述寡聚物的其余單體為BNA單體。7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述寡聚物的5'末端和所述寡聚物的3'末 端是BNA單體。8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其由12-18個(gè)單體組成。9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述更低親和力區(qū)域可與微小RNA的種子序 列堿基配對(duì)，或可與微小RNA的種子序列的RNA互補(bǔ)序列堿基配對(duì)。10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微小RNA，其中所述微小RNA是人微小RNA。
【專利摘要】本發(fā)明提供了結(jié)合RNA的寡聚物，其由更低親和力區(qū)域和更高親和力區(qū)域組成，其中更高親和力區(qū)域中的單體相較于更低親和力區(qū)域中使用的單體以更高的水平提高與RNA堿基配對(duì)的寡聚物的解鏈溫度(即親和力)，其中所述解鏈溫度的升高是相對(duì)于相同(堿基)序列的DNA單體的交替使用而言的。本發(fā)明的寡聚物可用于對(duì)靶RNA諸如mRNA和非編碼RNA的結(jié)合，并且具有這樣的有利方面：它們通過(guò)所述更低親和力區(qū)域的脫靶結(jié)合相較于通過(guò)所述更高親和力區(qū)域而言更不容易。
【IPC分類】C12N15/113, C07H21/00
【公開號(hào)】CN104955950
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380057694
【發(fā)明人】T·莫勒
【申請(qǐng)人】米爾克斯治療學(xué)公司
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2013年9月26日
【公告號(hào)】CA2886116A1, EP2900822A1, WO2014048441A1