藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的提取方法及測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物利用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種藕節(jié)中多糖和白樺脂酸的綜合提取方 法，尤其涉及一種利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化藕節(jié)多糖和白樺脂酸的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藕節(jié)為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaerth.的干燥根莖節(jié)部，為蓮藕的非食 用部分，不僅是良好的滋補(bǔ)品，而且是很好的中藥材，具有涼血、化瘀、止血的功效。我國(guó)浙 江、江蘇、湖北、山東等地蓮藕資源豐富，多數(shù)藕節(jié)被當(dāng)作廢物處理，不僅浪費(fèi)寶貴的中藥資 源，而且對(duì)環(huán)境造成一定的污染和破壞。
[0003] 白樺脂酸是一種三萜類(lèi)化合物，具有抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有廣 譜細(xì)胞毒性，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有傷害，是極有開(kāi)發(fā)前景的藥物。藕節(jié)中含有白樺脂酸，已有 報(bào)道從藕節(jié)中分離出白樺脂酸的構(gòu)象異構(gòu)體表白樺脂酸，專(zhuān)利號(hào)為CN101768200A的中國(guó) 專(zhuān)利于2010年7月7日公開(kāi)了藕節(jié)中表白樺脂酸的提取工藝。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)綜合對(duì)藕節(jié)中的白樺脂酸和多糖的綜合提取利用的穩(wěn)定 可靠的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝設(shè)計(jì)合理，操作方便簡(jiǎn)單， 穩(wěn)定可靠，提取效率高，提取得到的白樺脂酸和多糖純度高，易于工業(yè)化生產(chǎn)的利用響應(yīng)曲 面法優(yōu)化藕節(jié)多糖和白樺脂酸的提取方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供藕節(jié)中多糖和白樺脂 酸的測(cè)定方法。
[0006] 技術(shù)方法：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的提取方法，其包括以下步驟：
[0008] (1)白樺脂酸的提?。喝∨汗?jié)，粉碎過(guò)40目篩，加入藕節(jié)粗粉重量40~50倍體積 量的乙醇，50Hz~IOOHz的超聲頻率，可預(yù)浸泡0. 5h，超聲提取1~3次，每次lOOmin，得到 白枠脂酸；
[0009] (2)多糖的提?。喝〔襟E（1)提取白樺脂酸后的藕節(jié)濾渣，依次用無(wú)水乙醇、乙酸 乙酯洗滌，揮干乙醇和乙酸乙酯，加入藕節(jié)濾渣重量40~50倍量體積的水，然后在95°C~ l〇〇°C溫度加熱回流提取1~3次，每次125min，提取得到多糖。
[0010] 作為優(yōu)選方案，以上所述的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的提取方法，步驟（1)中加入 藕節(jié)粗粉重量49倍量體積的乙醇，乙醇體積濃度為95%。
[0011] 作為優(yōu)選方案，以上所述的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的提取方法，步驟（2)中加入 藕節(jié)濾渣重量50倍量體積的水，然后在95°C溫度加熱回流提取1~3次，每次125min。
[0012] 本發(fā)明所述的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的測(cè)定方法，其包括以下步驟：
[0013] (1)白樺脂酸樣品與多糖的溶液制備
[0014] 白樺脂酸的提?。喝∨汗?jié)，粉碎過(guò)40目篩，加入藕節(jié)粗粉重量40~50倍體積量的 乙醇，50Hz~IOOHz的超聲頻率，超聲提取1~3次，每次lOOmin，提取液抽濾后進(jìn)行8000r/ min離心10min，過(guò)0. 44 μ m濾膜，得到白樺脂酸待測(cè)液；
[0015] 多糖的提?。喝〔襟E（1)提取白樺脂酸后的藕節(jié)濾渣，依次用無(wú)水乙醇、乙酸乙 酯洗滌，揮干乙醇和乙酸乙酯，加入藕節(jié)濾渣重量40~50倍量體積的水，然后在95°C~ l〇〇°C溫度加熱回流提取1~3次，每次125min，提取得到多糖，8000r/min離心10min，精密 量取上清液進(jìn)行酸性、中性多糖測(cè)定；
[0016] (2)白樺脂酸及多糖標(biāo)準(zhǔn)品的配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0017] ①標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備
[0018] 白樺脂酸對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取白樺脂酸3. 12mg，置5mL容量瓶中，用甲醇 定容至刻度線，得到624 μ g/mL濃度白樺脂酸的對(duì)照品溶液；
[0019] 葡萄糖對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取12. 61mg葡萄糖于IOOmL容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水定 容至100mL，得到0. 1261mg/mL濃度的葡萄糖溶液；
[0020] 葡萄糖醛酸對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取11. 22mg葡糖糖醛酸置于IOOmL容量瓶?jī)?nèi)， 用蒸餾水定容至l〇〇mL，得到0. 1122mg/mL濃度的葡糖糖醛酸溶液；
[0021] ②白樺脂酸測(cè)定色譜條件及多糖測(cè)定方法
[0022] 取規(guī)格為150mmX4. 6mm，5 μπι的Apollo C18色譜柱；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為 0.2%磷酸水溶液，4相和8相體積比為80:20等度洗脫，流速：1111171^11，檢測(cè)波長(zhǎng) ：20711111， 柱溫：30°C，進(jìn)樣體積：20 μ L ;
[0023] 精密量取多糖提取液補(bǔ)足至lmL，加入5 %的苯酚2mL搖勻，再加入濃硫酸7mL搖 勻，置沸水浴20min，用紫外分光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定；
[0024] 精密量取多糖提取液補(bǔ)足至lmL，加入12. 5mmol/L四硼酸鈉硫酸溶液5mL，沸水浴 加熱1〇11^11，加入0.125%咔唑0.21^，再沸水浴151^11，用紫外分光光度計(jì)在51211111波長(zhǎng)下 測(cè)定；
[0025] ③標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
[0026] 取系列濃度的白樺脂酸，葡萄糖對(duì)照品和葡萄糖醛酸對(duì)照品按上述②方法測(cè)定， 建立白樺脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下表：
[0027] 葡萄糖、葡萄糖醛酸及白樺脂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0028]
[0029] (3)測(cè)定藕節(jié)白樺脂酸及多糖含量
[0030] 取步驟⑴制備得到的白樺脂酸樣品與多糖的溶液，按以上步驟（2)方法和白樺 脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定白樺脂酸樣品與多糖的溶液中白樺脂酸，葡萄 糖醛酸及葡萄糖的含量。
[0031] 作為優(yōu)選方案，以上所述的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的測(cè)定方法，步驟（1)中加入 藕節(jié)粗粉重量49倍量體積的乙醇，乙醇體積濃度為95%。
[0032] 作為優(yōu)選方案，以上所述的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的測(cè)定方法，步驟（1)中加入 藕節(jié)濾渣重量50倍量體積的水，然后在95°C溫度加熱回流提取1~3次，每次125min。
[0033] 藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的提取方法的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)：
[0034] (1)白樺脂酸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0035] 單因素實(shí)驗(yàn)
[0036] 提取白樺脂酸時(shí)依次改變提取溶劑乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲頻率、預(yù)浸 時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，用HPLC法測(cè)定所得的藕節(jié)白樺脂酸提取液中白樺脂酸的 含量，并按下式計(jì)算白樺脂酸產(chǎn)率，每次處理重復(fù)三次。
[0037] 白樺脂酸產(chǎn)率（％) =(提取液中白樺脂酸質(zhì)量/藕節(jié)干重總質(zhì)量）X 100%
[0038] 響應(yīng)面曲線法
[0039] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取白樺脂酸提取效果影響較顯著的提取溶劑乙醇濃度、 提取時(shí)間、料液比這3個(gè)因素，利用Design-Expert8. 0軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度A、料液比B、提取時(shí)間C為自變量，以白樺脂酸的產(chǎn)率為響應(yīng)值Y， 建立多元二次回歸方程：Y = 〇· 6+0. 087A+0. 035B+0. 034C+0. 030AB-0. 025AC+0. 014BC-0. 0 45A2-0. 029B2-0. 044C2。
[0040] (2)多糖實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0041] 單因素實(shí)驗(yàn)
[0042] 提取藕節(jié)多糖時(shí)依次改變提取溫度、提取時(shí)間、料液比、預(yù)浸時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行 單因素試驗(yàn)，用苯酚-硫酸法測(cè)定中性多糖，咔唑-硫酸法測(cè)定酸性多糖得到酸性、中性多 糖含量，并按下式計(jì)算多糖產(chǎn)率，每次處理重復(fù)三次。
[0043] 中性多糖產(chǎn)率（％) =(提取液中酸性多糖質(zhì)量/藕節(jié)干重總質(zhì)量）X 100%
[0044] 酸性多糖產(chǎn)率（％) =(提取液中酸性多糖質(zhì)量/藕節(jié)干重總質(zhì)量）X 100%
[0045] 響應(yīng)面曲線法
[0046] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取多糖提取效果影響較顯著的提取溫度、提取時(shí)間、料液 比這3個(gè)因素，利用Design-Expert8. 0軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以 提取溫度A、提取時(shí)間B、料液比C為自變量，以多糖的產(chǎn)率為響應(yīng)值Y，建立多元二次回歸方 程：Y = 8. 39+11. 05A+1. 06B+1. 60C+1. 44AB+2. 74AC+1. 24BC-6. 98Α2-1· 22Β2-2· 50C2。
[0047] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化
[0048] 利用Design-Expert8. 0軟件根據(jù)多元二次回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到回歸方 程的響應(yīng)面及其等高線圖，優(yōu)化出上述技術(shù)方案中最佳的白樺脂酸和多糖的提取工藝條 件。
[0049] 有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
[0050] 1、本發(fā)明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)選出最佳的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的最佳提取方法， 與正交法相比，本發(fā)明采用Box-BehnkenDesignS(BBD)中心組合設(shè)計(jì)模型的響應(yīng)面分析 法，用3個(gè)變化因子、3個(gè)水平及少量的實(shí)驗(yàn)組（僅17組實(shí)驗(yàn)）優(yōu)化出藕節(jié)中白樺脂酸和多 糖的最佳提取方法，獲得最佳產(chǎn)率，本發(fā)明優(yōu)選得到的提取方法在提高提取效率的同時(shí)，可 降低能耗和污染物排放，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際意義。
[0051] 2、本發(fā)明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)選出最佳的藕節(jié)中白樺脂酸和多糖的最佳提取方法， 然后通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出藕節(jié)中白樺脂酸和多糖含量的測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)，為 藕節(jié)白樺脂酸及多糖的高效利用提供科學(xué)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0052] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0053] 圖1白樺脂酸對(duì)照品HPLC色譜圖
[0054] 圖2藕節(jié)樣品HPLC色譜圖
[0055] 圖3醇濃度和料液比交互作用影響白樺脂酸提取率的響應(yīng)面和等高線圖
[0056] 圖4醇濃度和提取時(shí)間交互作用影響白樺脂酸提取率的響應(yīng)面和等高線圖
[0057] 圖5料液比和提取時(shí)間交互作用影響白枠脂酸提取率的響應(yīng)面和等尚線圖
[0058] 圖6提取溫度和提取時(shí)間交互作用影響多糖提取率的響應(yīng)面和等高線圖
[0059] 圖7提取溫度和料液比交互作用影響多糖提取率的響應(yīng)面和等高線圖
[0060] 圖8提取時(shí)間和料液比交互作用影響多糖提取率的響應(yīng)面和等高線圖 [0061] 圖9各提取單因素對(duì)藕節(jié)白樺脂酸提取率的影響曲線
[0062] 圖10各提取單因素對(duì)藕節(jié)多糖提取率的影響曲線圖
【具體實(shí)施方式】
[0063] 實(shí)施例1響應(yīng)面曲線法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0064] ①白樺脂酸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析 [0065] 單因素實(shí)驗(yàn)
[0066] 提取白樺脂酸時(shí)依次改變提取溶劑乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲頻率、預(yù)浸 時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，用HPLC法測(cè)定所得的藕節(jié)白樺脂酸提取液中白樺脂酸的 含量，并按下式計(jì)算白樺脂酸產(chǎn)率，每次處理重復(fù)三次。
[0067] 白樺脂酸產(chǎn)率（％) =(提取液中白樺脂酸質(zhì)量/藕節(jié)干重總質(zhì)量）X 100 %
[0068] 響應(yīng)面曲線法
[0069] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取白樺脂酸提取效果影響較顯著的提取溶劑乙醇濃度、 提取時(shí)間、料液比這3個(gè)因素，利用DesignExpert8. 0軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（設(shè)定結(jié)果見(jiàn)表1)，以乙醇濃度A、料液比B、提取時(shí)間C為自變量，以白樺脂酸的 產(chǎn)率為響應(yīng)值Y (實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2)，建立多元二次回歸方程：Y = 0. 6+0. 087A+0. 035 B+0. 034C+0. 030AB-0. 025AC+0. 014BC-