一株粘細(xì)菌菌株及其抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株粘細(xì)菌菌株及其抗腫瘤活性蛋白，尤其是涉及一株高效抗腫瘤野 生型菌株sp.STXZ72)及其活性假想蛋白的分離與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘細(xì)菌（Myxobacteria)是一類呈革蘭陰性單細(xì)胞桿狀，嚴(yán)格好氧的化能異養(yǎng)型 原核微生物。Dawid報道粘細(xì)菌更傾向于分布在低煒度，溫度稍高，氣候溫和的地區(qū)。在土 壤中它可以休眠體的形式存活數(shù)年以上，在合適的營養(yǎng)條件下能重新萌發(fā)形成營養(yǎng)細(xì)胞， 進(jìn)行營養(yǎng)生長。近年來的研宄表明，土壤已成為分離粘細(xì)菌的主要源材料。
[0003] 目前已知的大多數(shù)抗生素之類的藥物基本都取自于為數(shù)不多的幾種微生物，其中 有大約65%來自于放線菌，其余的基本上來自于桿狀菌屬、假單胞菌屬、真菌和霉菌。而這 些菌屬自50多年前就開始被用于抗生素的提取，時至今日，再想從這些微生物中篩選得到 新的活性物質(zhì)已經(jīng)相當(dāng)困難。但粘細(xì)菌中可以分離抗菌、抗真菌、抗腫瘤生物活性物質(zhì)無疑 拓寬了選擇范圍。
[0004] 癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的主要疾病之一，傳統(tǒng)的抗癌抗生素對腫瘤的治 療常因缺乏特異性而導(dǎo)致治療效果不佳或毒副作用大，從微生物中尋找新型抗腫瘤藥物成 為了熱點。粘細(xì)菌是一類重要的資源微生物，能產(chǎn)生多種抗腫瘤活性極高的代謝產(chǎn)物，是抗 腫瘤新藥物的重要來源。
[0005]目前從粘細(xì)菌中己發(fā)現(xiàn)大約600多種生物活性物質(zhì)。根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物數(shù)量 排名，粘細(xì)菌排在放線菌之后，假單胞桿菌之前，而與芽胞桿菌相當(dāng)。但粘細(xì)菌產(chǎn)生活性物 質(zhì)的陽性菌幾率卻是最高，幾乎所有的纖維堆囊菌屬能產(chǎn)生抗菌或抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn) 物，其中目前最受關(guān)注的是由纖維堆囊菌產(chǎn)生的Epothilones，它抑制微管解聚，引起腫瘤 細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是能替代紫杉醇的重要化合物，同時由于其水溶性更高，分子量更小，結(jié) 構(gòu)更簡單，對紫杉醇抗性的腫瘤細(xì)胞也有抑制效果且對作用過程更溫和，目前已進(jìn)入臨床 應(yīng)用階段。
[0006] 近年來，已經(jīng)從 應(yīng)cellosum.、Myxococcus stipitatus.、Chondromyces.、 Myxococcus xanthus、Archangiutn gephyra、Byssovorax cruenta、Myxococcus fulvu^^'熱細(xì)菌中分別分離得到了Epothilones、Disorazoles、Phoxalone、Sorangicin、Spirodienal， Rhizododin，ApicularensA、ApicularensB，MyxohelinA、Saframycin，ArchazolidA、 ArchazolidB、Tubulysin，Cruentaren，Myxothiazol等大環(huán)內(nèi)醋類、噻挫大環(huán)類、大環(huán)聚酮 類、雜環(huán)醌類、烯酸酯類、羅縮酮類等抗腫瘤活性物質(zhì)。2012年MarijkeH等研宄發(fā)現(xiàn)一種 蛋白SC3對小鼠S180實體瘤具有治療效果，說明對于蛋白類物質(zhì)抗腫瘤的研宄與小分子相 比同樣有重要意義。近年來，對粘細(xì)菌的代謝產(chǎn)物的研宄主要集中在其小分子化合物的鑒 定及活性研宄方面，從粘細(xì)菌中分離的Epothilones，Disorazoles 通過抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂引起細(xì)胞凋亡；從橙色粘球菌?中分離到 Myxothiazol作用于細(xì)胞色素bClC2復(fù)合物及細(xì)胞色素C2氧化還原酶，從而抑制腫瘤細(xì)胞 的呼吸，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。而對于粘細(xì)菌中抗腫瘤活性蛋白的研宄還未見報道。Marijke H等研宄發(fā)現(xiàn)一種蛋白SC3對小鼠S180實體瘤具有治療效果，分子量為100 kDa左右，已 發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的蛋白類物質(zhì)分子量大小在4 kDa-200 kDa之間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株具有廣譜高效抗腫 瘤活性的粘細(xì)菌菌株及其抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是： 本發(fā)明之粘細(xì)菌菌株，是粘球菌屬sp. STXZ72)，該菌種于2015年 6月4日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保 藏號為 CCTCC NO :M2015353。
[0009] 本發(fā)明之粘球菌屬STXZ72 sp. STXZ72)的分離鑒定：采用滅活大 腸桿菌誘導(dǎo)子實體分離法，從牛糞便周邊土樣中直接分離得到一株具有粘細(xì)菌性狀的細(xì) 菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鑒定該菌株為 屬，命名為粘球菌 STXZ72 ( sp. STXZ72)。
[0010] 抗腫瘤生物活性： 利用優(yōu)化的MD1 (酪蛋白胨培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基進(jìn)行ifjucoccmsp.STXZ72發(fā)酵培 養(yǎng)，按接種量3%接種發(fā)酵培養(yǎng)7d，離心收集上清，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒性實驗。
[0011] 抗腫瘤活性物質(zhì)分離純化： 將sp.STXZ72接種于MD1 (酪蛋白胨培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基，于30°C，180rpm/min，振蕩培養(yǎng)7d后，8000 - 12000rpm/min離心15min;收集發(fā)酵上清液，收集硫酸 銨濃度50%-80%的沉淀，在蛋白質(zhì)純化儀上進(jìn)行分離，收集具有生物活性的組分。蛋白質(zhì)純 化儀上所用凝膠柱優(yōu)選為SephadexG75葡聚糖凝膠柱；流動相：水；流速0. 5mL/min;上 樣量：100yL(微升)。
[0012] 利用以上分離純化方法所得sp. STXZ72的代謝產(chǎn)物，經(jīng)抗腫瘤活性 測定，證明：具有高效抑制多種腫瘤細(xì)胞活性，同時對正常人臍靜脈上皮細(xì)胞毒性小。
[0013] LC-MS/MS鑒定顯示以上分離純化方法所得sp. STXZ72的抗腫瘤活性 代謝產(chǎn)物為一種假想蛋白。
[0014] 本發(fā)明中的抗腫瘤活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)，分子量為74. 5kDa，通過氨基酸序列分析 發(fā)現(xiàn)其380-660位氨基酸組成蛋白酶活性結(jié)構(gòu)域，此蛋白酶結(jié)構(gòu)域與其抗腫瘤效果有關(guān)。
[0015] 微生物保藏情況說明 本發(fā)明之粘細(xì)菌菌株，是粘球菌屬sp. STXZ72)，該菌種于2015年 6月4日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保 藏號為 CCTCC NO :M2015353。
【附圖說明】
[0016] 圖1是菌株sp.STXZ72的形態(tài)特征圖；A，WAX平板上菌落形態(tài)；B，革 蘭氏染色營養(yǎng)細(xì)胞； 圖2是菌株sp. STXZ72生長曲線圖； 圖3是ifjucoccmsp.STXZ72菌株發(fā)酵上清對多種腫瘤細(xì)胞的抑制效果圖；（a為加 入發(fā)酵培養(yǎng)基作用后人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的形態(tài)，b為加入發(fā)酵上清液作用后人乳腺癌細(xì) 胞MCF-7的形態(tài)；c為加入發(fā)酵培養(yǎng)基作用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的形態(tài)，d為加入發(fā) 酵上清液作用后人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的形態(tài)；e為加入發(fā)酵培養(yǎng)基作用后小鼠乳腺癌 細(xì)胞4T1的形態(tài)，f為加入發(fā)酵上清液作用后小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的形態(tài)；g為加入發(fā)酵培 養(yǎng)基作用后小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的形態(tài)，h為加入發(fā)酵上清液作用后小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16 ;i為加入發(fā)酵培養(yǎng)基作用后人肝癌細(xì)胞H印-3B的形態(tài)，j為加入發(fā)酵上清液作用后人 肝癌細(xì)胞H印-3B的形態(tài)；k為加入發(fā)酵培養(yǎng)基作用后人人宮頸癌細(xì)胞Hela的形態(tài)，1為加 入發(fā)酵上清液作用后人宮頸癌細(xì)胞Hela的形態(tài)）； 圖4是硫酸按沉淀和丙酮沉淀對sp.STXZ72發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性影 響圖（A是硫酸銨沉淀處理發(fā)酵上清液后收集的上清，C是丙酮沉淀處理發(fā)酵上清液后收 集的上清；B是硫酸銨沉淀處理發(fā)酵上清液后收集的沉淀，D是丙酮沉淀處理發(fā)酵上清液 后收集的沉淀）； 圖5是溫度對ifjucoccmsp.STXZ72發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性影響圖（圖標(biāo)數(shù)字代 表不同的溫度）； 圖6是蛋白酶K對ifjucoccmsp.STXZ72發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性影響圖（A是5UL培養(yǎng)基作用后人乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)，D是10yL培養(yǎng)基作用后人乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)； B是5yL發(fā)酵上清液作用后人乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)，E是10yL發(fā)酵上清液作用后人乳腺 癌細(xì)胞的形態(tài)；C為5yL蛋白酶K處理的發(fā)酵上清液后作用后人乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)，F(xiàn)為 10UL蛋白酶K處理的發(fā)酵上清液后作用后人乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)）； 圖7是粗分離蛋白在AKTAPurifier10的分離色譜圖； 圖8是AKTAPurifier10分離的各單峰組分對腫瘤細(xì)胞的抑制效果圖； 圖9是SDS-PAGE檢測分離蛋白純度圖（M:marker;1 :純化蛋白）； 圖10是sp. STXZ72分離抗腫瘤活性蛋白對多種腫瘤細(xì)胞及人正常臍靜 脈上皮細(xì)胞的抑制率測定圖； 圖11是sp. STXZ72分離抗腫瘤活性蛋白對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作 用圖。
【具體實施方式】
[0017] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 實施例
[0018] ①本實施例之粘球菌屬STXZ72(#j^ococ?/&g