一種玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病原真菌研宄技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種玉米小斑病菌產(chǎn)孢 培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米小斑?。⊿outherncornleafblight)是玉米生產(chǎn)上重要的病害，在我國(guó)分布 廣泛。玉米小斑病屬氣流傳播的病害。玉米小斑病菌產(chǎn)生的分生孢子在病菌傳播、侵染和致 病中起著重要的作用，分生孢子可借助氣流或者雨水傳播到田間生長(zhǎng)的玉米葉片上，在有 游離水滴的時(shí)候，分生孢子4-8h即可萌發(fā)產(chǎn)生芽管并侵入玉米葉片的表皮細(xì)胞，3-4d內(nèi)即 可形成病斑，之后病斑產(chǎn)生分生孢子，借助氣流傳播，對(duì)田間生長(zhǎng)的玉米進(jìn)行重復(fù)侵染。目 前利用作物品種抗病性及藥劑處理是防治該病害的主要措施，然而在病菌致病性測(cè)定、品 種抗病性鑒定和防治藥劑篩選試驗(yàn)中往往需要大量的人工培養(yǎng)的分生孢子作為研宄試驗(yàn) 材料，而分生孢子來源及其萌發(fā)效果將直接影響著試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中常采用PDA培養(yǎng)基或高梁粒培養(yǎng)基進(jìn)行玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)。研宄 發(fā)現(xiàn)，由前者培養(yǎng)獲得的孢子形態(tài)常大小不一、孢子萌發(fā)率低、萌發(fā)芽管長(zhǎng)短不一，而后者 在病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢過程中較為繁瑣，需洗去高梁粒表面的菌絲，然后暴露在空氣中使之產(chǎn)孢， 操作不當(dāng)易造成污染，產(chǎn)孢量下降，因此尋找一種簡(jiǎn)便的適宜玉米小斑病菌大量產(chǎn)孢的培 養(yǎng)基具有一定的意義。
[0004] 在殺菌劑抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，通常采用凹玻片法。采用凹玻片法，玉米 小斑病菌孢子萌發(fā)效果很差，萌發(fā)不整齊。采用水瓊脂平板表面萌發(fā)法由于病菌孢子接觸 的水分和氧氣較一致，玉米小斑病菌孢子萌發(fā)效果明顯好于凹玻片法。但是，采用水瓊脂平 板表面萌發(fā)法進(jìn)行殺菌劑抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)，通常需要相應(yīng)濃度的藥液進(jìn)行孢子 懸浮液的配制，然后再涂布含藥平板表面，操作過程比凹玻片法復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種有利于玉米小斑病菌生長(zhǎng)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方 法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明具體的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供一種玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，包括馬鈴薯、甘露醇、瓊脂粉和水，其 中，馬鈴薯200g/L，甘露醇5~10g/L，瓊脂粉14g/L。
[0008] 本發(fā)明還提供上述玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備方法，具體為：將200g馬鈴 薯洗凈后切塊，加水煮沸20-40min，將濾渣過濾，在濾液中加水補(bǔ)足至1L，并向其中加入 5-l〇g甘露醇和14g瓊脂粉混合溶解，滅菌冷卻得到玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基。優(yōu)選的，制 備產(chǎn)孢培養(yǎng)基過程中的滅菌條件為：121°C滅菌25min。
[0009] 本發(fā)明還包括上述玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的應(yīng)用，具體為玉米小斑病菌產(chǎn)孢培 養(yǎng)基在病菌藥劑篩選或在病菌致病性測(cè)定中的應(yīng)用。
[0010] 其中，所述玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基在病菌藥劑篩選過程中，首先需要先培養(yǎng)玉 米小斑病菌的分生孢子，以便于后期的接種。通常情況下，制備的產(chǎn)孢培養(yǎng)基在接種前需將 其制平板冷卻至凝固，再將活化的病菌菌塊移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面，28°c黑暗培養(yǎng)6~7天， 培養(yǎng)基表面即可產(chǎn)生大量形態(tài)一致、萌發(fā)效果好、萌發(fā)率高的分生孢子，產(chǎn)孢量約為等量 PDA培養(yǎng)基產(chǎn)量的1. 2~3. 6倍，萌發(fā)率可達(dá)90%以上，明顯高于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的孢 子。
[0011] 用本發(fā)明提供的玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基（下面簡(jiǎn)稱甘露醇培養(yǎng)基）在28°C黑暗 條件下培養(yǎng)病菌6~7天，使之產(chǎn)生大量的分生孢子后，在含有分生孢子培養(yǎng)基表面用無菌 濾紙片覆蓋，待濾紙片潤(rùn)濕后，將濾紙片移至含不同濃度藥劑的水瓊脂培養(yǎng)基表面，使沾有 孢子的濾紙片一面朝下，待該濾紙片與培養(yǎng)基表面接觸后，部分孢子能粘附在水瓊脂培養(yǎng) 基表面，再用鑷子轉(zhuǎn)移濾紙片至培養(yǎng)基表面另一處，重復(fù)在培養(yǎng)基表面轉(zhuǎn)移濾紙，最后除去 濾紙片完成玉米小斑病菌在培養(yǎng)基上的接種。本發(fā)明中對(duì)濾紙片在所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面轉(zhuǎn) 移次數(shù)沒有特殊限制，可以根據(jù)實(shí)際情況決定轉(zhuǎn)移次數(shù)，優(yōu)選轉(zhuǎn)移不超過3次。本發(fā)明對(duì)濾 紙的規(guī)格、形狀、大小等沒有具體的限制，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的濾紙進(jìn)行接種。在 本發(fā)明中使用的濾紙為1. 5X1. 5cm的方形濾紙片。
[0012] 接種完成后，在濾紙片處理的區(qū)域作相應(yīng)的標(biāo)記，然后蓋上培養(yǎng)皿皿蓋，在28°C黑 暗培養(yǎng)3h后，觀察病菌孢子的萌發(fā)情況，依據(jù)孢子萌發(fā)率大小評(píng)價(jià)藥劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制 效果，篩選出抑菌效果好的藥劑種類。本發(fā)明使用的濾紙片每皿可處理9個(gè)區(qū)域。本發(fā)明 對(duì)病菌孢子萌發(fā)情況的具體觀察方式?jīng)]有具體的限定，優(yōu)選使用100倍顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0013]由于病菌在甘露醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的、萌發(fā)效果好的分生孢子，用濾紙 片轉(zhuǎn)移孢子至含不同濃度的藥劑平板中，無需使用相應(yīng)濃度藥液稀釋，利用玉米小斑病菌 孢子的萌發(fā)特性便能有效快速地篩選出抑制孢子萌發(fā)效果好的藥劑種類及其濃度。該方法 減少了常規(guī)藥劑篩選試驗(yàn)中一些不必要的環(huán)節(jié)，且接種的區(qū)域孢子分布較集中，十分便于 觀察。
[0014] 本發(fā)明還包括玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基在病菌致病性測(cè)定中的應(yīng)用，具體方法 為：將活化的玉米小斑病菌菌塊移至所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面，28°c黑暗培養(yǎng)6~7天，獲得分 生孢子；在所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面注入清水，并刮洗培養(yǎng)基表面的孢子，過濾后用清水稀釋孢 子懸浮液，使分生孢子終濃度為1-10X105個(gè)/mL，將孢子懸浮液進(jìn)行玉米植株噴霧接種，接 種后調(diào)查玉米葉片發(fā)病情況，評(píng)價(jià)病菌對(duì)玉米的致病性。優(yōu)選接種后的植株用塑料薄膜覆 蓋保濕處理，保濕處理時(shí)間優(yōu)選為2天。
[0015] 本發(fā)明提供的玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基制作方法簡(jiǎn)便，制作成本低于常規(guī)的PDA 培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基。病菌在該培養(yǎng)基生長(zhǎng)，平板菌落長(zhǎng)勢(shì)良好，產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)效果 及接種致病效果明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)基，尤其適用于病菌的繼代培養(yǎng)。產(chǎn)孢量約為等量PDA 培養(yǎng)基產(chǎn)量的1. 2~3. 6倍，萌發(fā)率可達(dá)90%以上，明顯高于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的孢子。 在藥劑抑制病原菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，采用本發(fā)明提供的方法，既保障了適宜孢子萌發(fā)的條 件，又減少了常規(guī)藥劑篩選試驗(yàn)中一些不必要的環(huán)節(jié)，利用該病菌孢子的萌發(fā)特性便能快 速有效地篩選出抑制孢子萌發(fā)效果好的藥劑種類及其濃度。本發(fā)明提供的玉米小斑病菌產(chǎn) 孢培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法可為病菌的深入研宄提供參考。
【附圖說明】
[0016] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明：
[0017] 圖1是玉米小斑病菌在不同濃度的甘露醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落形態(tài)；其中從左至 右從上至下甘露醇的含量分別為〇、〇. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、2. 5%;
[0018] 圖2是玉米小斑病菌在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落形態(tài)；從左至右依次為1%甘露 醇、PDA、PSA培養(yǎng)基；
[0019] 圖3是玉米小斑病菌在不同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5代的菌落形態(tài)；從左至右依次為 1 %甘露醇、0. 5 %甘露醇、PDA培養(yǎng)基；
[0020] 圖4是玉米小斑病菌在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子形態(tài)；從左至右依次為1%甘露 醇、PSA、PDA培養(yǎng)基；
[0021] 圖5是不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子在水瓊脂平板上的萌發(fā)形態(tài)；從左至右依次為 1 %甘露醇、PSA、PDA培養(yǎng)基；
[0022] 圖6為用濾紙片轉(zhuǎn)移不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子至水瓊脂平板表面的過程示意圖；其 中，左邊為1.0 %甘露醇培養(yǎng)基，右邊為PDA培養(yǎng)基；
[0023] 圖7為100倍鏡下濾紙片上孢子粘附在水瓊脂平板上的情況；其中，a為1. 0%甘 露醇培養(yǎng)基用濾紙片1次轉(zhuǎn)移的孢子，b為PDA培養(yǎng)基用濾紙片1次轉(zhuǎn)移的孢子，c為從圖 a所示培養(yǎng)基用濾紙片2次轉(zhuǎn)移的孢子，d為從圖b所示培養(yǎng)基用濾紙片2次轉(zhuǎn)移的孢子。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地 描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā) 明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施 例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 實(shí)施例1 :不同培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢的影響
[0026] 供試菌株：玉米小斑病菌FJ。
[0027] 供試培養(yǎng)基：甘露醇培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng) 基（PSA培養(yǎng)基）和1. 4 %水瓊脂培養(yǎng)基。
[0028] 其中甘露醇培養(yǎng)基的制備方法如下：
[0029] 馬鈴薯稱重洗凈后切小塊，加水煮沸0. 5h，用紗布濾去馬鈴薯，加水補(bǔ)足至1L，分 裝三角瓶，然后按比例加入甘露醇和瓊脂粉，121°C滅菌25min，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右， 倒入直徑為8. 9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約25ml，備用。制備不同濃度甘露醇培養(yǎng)基原料的質(zhì)量 如表1 :
[0030] 表1甘露醇培養(yǎng)基各原料的質(zhì)量
[0032]
[0033]-試驗(yàn)方法：病菌活化好后，用直徑5mm的打孔器在菌落邊緣切取菌齡一致的菌餅， 并用接種針將菌餅接種到培養(yǎng)基平板中央，菌絲面朝下，每處理6次重復(fù)。28°C黑暗培養(yǎng)7 天（繼代培養(yǎng)重復(fù)此操作），采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，然后在各培養(yǎng)基表面分別注入 無菌水25mL，用無菌玻片的一端刮洗菌落表面上的分生孢子后，使孢子分散在水中，用無菌 紗布過濾，制孢子懸浮液，并在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子懸浮液濃度