檢測鴨疫里默氏桿菌的特異性引物及pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測鴨疫里默氏桿菌的特異性引物及PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌可引起家鴨、鶴、火雞及多種家 禽和野禽發(fā)病，導致的鴨的疾病稱為鴨傳染性衆(zhòng)膜炎（duckinfectiousserositis)。本 菌易感染1~8周齡的鴨，尤其是2~3周齡的小鴨，一周齡以下或8周齡以上的鴨極少發(fā) 病。本病的感染率有時可達90%以上，死亡率從5%至75%不等。目前鴨傳染性漿膜炎在我 國各養(yǎng)鴨省區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)病率和死亡率很高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要細菌病之一，給養(yǎng)鴨 業(yè)造成重大經濟損失。
[0003] 鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，目前報道確認的有21個血清型，我國目前至少存在 13個血清型（1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和15型)，其中1、2和10型是流行的優(yōu)勢血 清型。各血清型菌株間缺乏有效的交叉免疫保護，給疫苗預防帶來了很大難度。
[0004] 鴨疫里默氏桿菌感染在臨床癥狀和剖檢病變方面與大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏 菌感染有相似的地方，容易引起誤診，應用分子生物學方法確診該病至關重要。目前報道 的檢測鴨疫里默氏桿菌的方法有細菌分離培養(yǎng)、玻板凝集試驗、試管凝集試驗、瓊脂擴散試 驗、熒光抗體技術、間接免疫酶組織化學法、聚合酶鏈反應（PCR)等。PCR方法簡便、快速、特 異性和敏感性好，在臨床診斷中得到廣泛的推廣應用。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供了一對檢測鴨疫里默氏桿菌的特異性引物及相應的PCR檢測試劑盒。 本發(fā)明的試劑盒能夠大批量檢測臨床樣本，并且耗時短，成本低，操作簡單方便。
[0006] 本發(fā)明提供一對檢測鴨疫里默氏桿菌的特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序 列為： 上游引物ompA-F:5' -actcaaggaagagcggatca_3' 下游引物 〇mpA_R:5' -gcttcagcagaaccaactcc_3'〇
[0007] 上游引物ompA-F和下游引物ompA-R均位于鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(ompA) 基因上。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種鴨疫里默氏桿菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒 包括特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列為： 上游引物ompA-F:5' -actcaaggaagagcggatca_3' 下游引物 〇mpA_R:5' -gcttcagcagaaccaactcc_3'〇
[0009] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0010] 進一步地，所述陽性對照為含有鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(ompA)基因的部分核 苷酸序列的重組質粒，該部分核苷酸序列的長度為809bp，具體序列參見序列表中SEQID No. 3〇
[0011] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測DNA為模板，利用 權利要求2所述的特異性引物進行PCR擴增，將擴增產物電泳，若擴增到約809bp的DNA片 段，判為陽性；反之，判為陰性。
[0012] 優(yōu)選地，所述PCR反應條件為：94°C5min，35 個循環(huán)（94°C30s，60°C30s，72°C 40s)，最后 72°C5min。
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種鴨疫里默氏桿菌的檢測方法，是以待測DNA為模 板，利用權利要求2所述的特異性引物進行PCR擴增，將擴增產物電泳，若擴增到約809bp 的DNA片段，則檢測到鴨疫里默氏桿菌。
[0014]優(yōu)選地，所述PCR反應條件為：94°C5min，35 個循環(huán)（94°C30s，60°C30s，72°C 40s)，最后 72°C5min。
[0015] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述特異性引物、試劑盒、序列表中SEQIDNo. 3所述 的核苷酸序列在制備檢測鴨疫里默氏桿菌的試劑中的應用。
[0016] 本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)越性包括以下方面： a.試劑盒操作簡單方便，適合在各基層獸醫(yī)有關單位以及養(yǎng)殖場廣泛推廣使用，本發(fā) 明中的試劑盒在檢測樣品時只需要移液器、移液器槍頭、PCR儀以及臺式離心機，普通實驗 室均可使用本試劑盒檢測樣本。
[0017]b.結果判定直觀，電泳后眼觀即可。
[0018]c.操作人員不必接受專業(yè)培訓，只參照說明書就可進行檢測。
[0019]d.成本低廉，經濟實惠，大多使用者均可接受。
[0020] 本發(fā)明提供了一種從臨床樣本或純培養(yǎng)菌中檢測鴨疫里默氏桿菌核酸的PCR方 法，該方法不受鴨疫里默氏桿菌血清型的限制，能夠檢測各種血清型的鴨疫里默氏桿菌，具 有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0021] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本發(fā)明試劑盒的特異性檢測實驗結果；其中，泳道M為DL2000分子量標準；泳道 1-5為鴨疫里默氏桿菌；泳道6-7為大腸桿菌；泳道8-9為沙門氏菌；泳道10-11為巴氏桿 菌。
[0022] 圖2為本發(fā)明試劑盒的敏感性檢測實驗結果；其中，泳道M為DL2000分子量標準； 泳道 1-7 的DNA模板量分別為 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg。
【具體實施方式】
[0023] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0024] 實施例1 本發(fā)明的一種鴨疫里默氏桿菌PCR檢測試劑盒包括： 1. 2XPCRTaqMix5 支（250yl/支）； 2?上游引物ompA-F1支（50yl/支）； 3?下游引物ompA-R1支（50yl/支）； 4?陽性對照DNA1支（250yl/支） 5. 陰性對照DNA1支（250y1/支）； 6. 滅菌去離子水1支（1000yl/支)。
[0025] 上述試劑盒可檢測50份樣本，-20°C凍存，保存期為1年。
[0026] 其中，2XPCRTaqMix由市場購買； 上游引物〇mpA-F的序列為： 5? -actcaaggaagagcggatca~3,, 下游引物〇mpA-R的序列為： 5' -gcttcagcagaaccaactcc-3'。該引物序列可由人工合成。
[0027] 陽性對照DNA:以鴨疫里默氏桿菌的基因組DNA為模板，以本發(fā)明中涉及的ompA-F 和ompA-R為引物，擴增目的片段。擴增程序為：94°C5min，35個循環(huán)（94°C30s，60°C30s， 72°C40s)，最后72°C5min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用商品化試劑盒回收、純化 目的DNA片段，與pMD19-T載體連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布含80yg/ml氨芐青 霉素的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌株，接種到含80yg/ml氨芐青霉素的 5ml營養(yǎng)肉湯內，37°C，200rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經測序鑒定正確的菌株為陽性菌株。用 細菌DNA提取試劑盒提取陽性菌株中的重組質粒pMD-ompA，作為陽性對照； 陰性對照DNA:多殺性巴氏桿菌CVCC386購買于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。取甘油凍存的CVCC386菌株5y1，接種到5ml營養(yǎng)肉湯內，37°C，200rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用細菌DNA 提取試劑盒提取其基因組DNA，作為陰性對照； 滅菌去離子水：去離子水121°C高壓滅菌30min。
[0028] 實施例2 本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌PCR檢測試劑盒的使用方法為： 1.從純細菌培養(yǎng)物、病死鴨的腦組織、心血、肝臟、脾臟、肺臟等病料中提取總DNA。DNA的提取可使用商品化試劑盒。
[0029] 2.將試劑盒中的2XPCRTaqMix、上游引物ompA-F、下游引物ompA-R、滅菌去離 子水和提取的DNA模板配制成PCR反應液，總體系50y1。同時用試劑盒中的陽性對照DNA 作為模板，擴增陽性對照；用試劑盒中的陰性對照DNA作為模板，擴增陰性對照。PCR反應 液的具體配制方法如表1 :