一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋 白的制備方法。
【背景技術】
[0002] 嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila)廣泛存在于自然界的淡水、污水和土壤 中，通過污染的水和相關產品感染人類。臨床癥狀表現(xiàn)為胃腸炎，皮膚和軟組織感染，也是 淡水養(yǎng)殖較為嚴重的病原菌之一。會導致魚類的出血性敗血癥、積水、潰瘍、無癥狀敗血癥 和眼球突出等。此菌存在有多種血清型，隨地域和宿主的不同而有所差異，限制了滅活疫苗 的使用范圍。解決此問題的關鍵在于找出嗜水氣單胞菌的共同保護性抗原，以制備對不同 血清型菌株均有保護作用的疫苗。外膜蛋白（outermembraneprotein，0MP)是革蘭氏陰 性菌細胞壁的主要成分。它鑲嵌于細菌外膜的中間，在維持細菌外膜結構、物質轉運方面發(fā) 揮著重要作用。有許多研宄結果表明，細菌的主要外膜蛋白的免疫原性很強，是重要的保護 性抗原，ompA蛋白族是革蘭氏陰性菌外膜中的主要成分并且是保守的，其主要作用是維持 外膜的完整。缺少ompA和胞壁脂蛋白的細菌變異株其形態(tài)為球形，細胞膜也不穩(wěn)定。健康 的動物具有抵抗病原微生物的侵襲和感染的能力，機體可依靠皮膚、粘膜、血腦等屏障結構 阻止病原微生物的進入，還可通過組織和體液中的抗微生物物質如補體、溶菌酶、干擾素等 進行抑菌、殺菌或溶菌，機體這一系列的免疫反應限制或抵制了細菌的復制。因此，病原菌 的致病作用必須能夠逃避或適應宿主的防御，許多研宄已證實，某些細菌的0MP在細菌致 病過程中起著重要的作用。用SDS-PAGE分析了致禽敗血癥的大腸埃希氏菌0MP，發(fā)現(xiàn)禽大 腸埃希氏菌非致病或表現(xiàn)很髙LD5(I的菌株都缺乏僅在致病菌株中才有的40. 7和28. 8KD的 2種主要蛋白亞單位，說明這2種蛋白可能在禽敗血癥的致病過程中起作用，因此，利用致 病菌的0MP做免疫原可使魚免受產生對不同血清型菌株感染的交叉保護力。
[0003] 魚類的非特異性防御機制可以分為體液防御和細胞防御兩種方式，并且這兩種方 式都是先天形成的，沒有特異性能，作用于所有的外來病原微生物、也無遺傳性和記憶性。 其中溶菌酶、補體和巨噬細胞呼吸暴發(fā)活性是評價魚類非特異性免疫防御的重要指標。
[0004] 由此可見，能否利用嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因進行原核表達從而制備一種蛋 白，使其可作為對魚具有保護作用的疫苗，成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明為了解決上述技術問題，提供一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋 白的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術方案包括：
[0007] -種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白，所述的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基 因原核表達蛋白氨基酸序列為SEQIDN0. 1，所述的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因核苷酸序 列為SEQIDN0. 2。
[0008] -種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的應用，所述的嗜水氣單胞菌外膜 蛋白基因原核表達蛋白可作為抗原在制備預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑中使用。
[0009] 所述預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑還包括弗式不完全佐劑。
[0010] 所述弗式不完全佐劑同所述嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白體積比為 1:1〇
[0011] 一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的應用，所述的預防嗜水氣單胞菌 的疫苗制劑的制備方法包括以下步驟：在無菌注射器中加入制備好的嗜水氣單胞菌外膜蛋 白基因原核表達蛋白，用移液器向所述無菌注射器中加入等體積的弗式不完全佐劑，乳化 5min后，用注射器反復推進，直至水相與油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色 液滴，即制成疫苗制劑。
[0012] 一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 步驟一：嗜水氣單胞菌基因組DNA提取及嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因的克隆；從 嗜水氣單胞菌分離株提取基因組DNA，根據嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因序列設計特異性引 物，進行PCR擴增反應，將得到的PCR擴增產物純化后，以載體和插入片段物質的量之比1 : 3的比例克隆入PMD18-T載體，在含氨芐青霉素的LB平板上挑取陽性克隆，經雙酶切和PCR 鑒定后，獲得陽性克隆提取質粒DNA;
[0014] 步驟二：表達質粒構建：對測序正確的所述陽性克隆提取質粒DNA進行BamHI、 HandIII酶切，同時用相同的內切酶對表達質粒pET-30a酶切，膠純化回收酶切的目的基因 片段和pET-30a載體片段，建立連接反應，得到重組質粒pET-32a(+) -pompA，將所述重組質 粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布LB平板，挑取單個菌落，接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提 質粒，經酶切鑒定、PCR反應陽性鑒定后得到包含重組質粒pET-32a(+)-pompA的陽性重組 大腸桿菌；
[0015] 步驟三：嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的誘導表達和純化：將所述陽 性重組大腸桿菌劃線接種于Amp抗性的LB平板培養(yǎng)至00_達0. 6時，加入IPTG至終濃度 為1.Ommol/L進行誘導表達，將誘導表達的菌液進行超聲波破碎和鑒定，洗滌、溶解、過濾 后即得嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白。
[0016] 所述特異性引物為：上游引物：5' -CCATGGGCATGTGTTTAC-3' ；下游引物： 5'-GGATCCGACTGGTAGA-3'，上游引物序列為SEQIDN0. 3,下游引物序列為SEQIDN0. 4,采 用Ncol酶切所述上游引物，采用BamHI酶切所述下游引物。
[0017] 所述？〇?擴增反應的體系為25 1^:2父139]\&18七61]^112.5 111，0嫩模板1111， 上游引物和下游引物各1. 〇y1，補加ddH20至25y1 ;所述PCR擴增反應的條件：95°C預變 性5min，94°C50s，55°C30s，72°C50s，共 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 10min，取 5y1 反應產 物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結果。
[0018] 所述步驟二中抽提質粒的方法為堿裂解法。
[0019] 所述步驟三中將所述陽性重組大腸桿菌劃線接種于Amp抗性的LB平板培養(yǎng)的方 法為：37°C培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落接種于10mLLB培養(yǎng)液中，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，將 過夜培養(yǎng)的菌液按1:50的比例接種于5mLLB培養(yǎng)液中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D_達0. 6。
[0020] 所述步驟三中誘導表達的過程為：誘導4h后，取lmL菌液4°C、12000rpm離心 lmin，棄去上清；沉淀中加入40y1的Tris-HCl緩沖液和10y1的5XSDS上樣緩沖液， 100°C水浴加熱變性lOmin，然后進行12%SDS-PAGE分析。
[0021] 所述步驟三中洗滌、溶解、過濾的過程為：經超聲波破碎和鑒定后的所述誘導表達 的菌液的沉淀用含2M尿素的包涵體洗滌液洗滌，洗滌后8000r/min離心lOmin倒去上清， 連續(xù)3次，每次5min;最后用含6M鹽酸胍的緩沖液溶解重組蛋白，溶解至清亮，將溶解后的 溶液，用〇. 45ym孔徑的濾膜過濾。
[0022] 本發(fā)明的有益效果包括：本發(fā)明選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白ompA基因在大腸桿 菌中進行表達并分析其免疫原性，提供一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制 備方法，并與弗式不完全佐劑（FIA)結合，比較研宄了嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表 達蛋白pompA在不同F(xiàn)IA作用下對斑點叉尾鮰的免疫效果。為進一步研宄ompA及其能否 作為基因工程亞單位疫苗的候選成分奠定基礎。
【附圖說明】
[0023] 圖1所示為本發(fā)明PCR擴增結果圖。
[0024] 圖2所示為本發(fā)明T克隆質粒pMD19-T-pompA酶切鑒定和PCR鑒定圖。
[0025] 圖3所示為本發(fā)明重組表達質粒pET-32a(+)-pompA酶切鑒定和PCR鑒定圖。
[0026] 圖4所示為本發(fā)明重組pompA的表達分析圖。
[0027] 圖5所示為本發(fā)明預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑對血清溶菌酶活力的影響比較 圖。
[0028] 圖6所示為本發(fā)明預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑對血清ACH50活力影響比較圖。
[0029] 圖7所示為本發(fā)明不同溫度處理血清殺菌活性比較圖。
[0030] 圖8所示為本發(fā)明預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑對頭腎巨噬細胞呼吸暴發(fā)活性。
[0031] 圖9所示為本發(fā)明預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑對血清調理吞噬作用比較圖。