華法林個體化用藥檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及華法林個體化用藥檢測試 劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 華法林是目前廣泛應(yīng)用于臨床的香豆素類口服抗凝血藥物，可防止血栓的形成與 發(fā)展，例如治療血栓栓塞性靜脈炎、風(fēng)濕性心臟病、人工置換心臟瓣膜手術(shù)、髖關(guān)節(jié)固定術(shù) 以及降低肺栓塞的發(fā)病率和死亡率，亦可用于心肌梗死患者的輔助用藥。華法林的抗凝血 效果雖強(qiáng)于目前批準(zhǔn)的其它抗凝血類藥物，但是由于華法林個體劑量的變動性非常大，如 不能按照個體差異用藥會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗凝不足或者藥物過量引起致死性出血，這就為華法 林的臨床使用帶來極大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)階段臨床上在應(yīng)用華法林抗凝治療時，基本是先給予患 者一定常規(guī)劑量的藥物，臨床醫(yī)生再根據(jù)患者的INR值不斷調(diào)整藥物劑量，直到患者INR達(dá) 到預(yù)期目標(biāo)值。整個過程周期很長，患者需反復(fù)進(jìn)行INR檢測，如此又會加重患者的心理負(fù) 擔(dān)。
[0003] 影響華法林作用的因素包括性別、年齡、疾病、飲食中維生素K的攝入量以及遺 傳因素，近年來隨著分子生物學(xué)的深入研宄發(fā)現(xiàn)，遺傳變異是引起華法林個體應(yīng)用差異 最重要的因素，其主要集中在華法林藥代動力學(xué)代謝環(huán)節(jié)------細(xì)胞色素P450同工 酶2C9 (CYP2C9)和藥效動力學(xué)受體環(huán)節(jié)------維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位 1 (VK0RC1)。華法林主要在肝臟中由肝微粒體CYP450酶代謝，這其中包括CYP2C9、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C18、CYP1A2和CYP3A4,其中最為主要的是CYP2C9,其代謝物S-7-羥基華 法林提供了華法林70%的抗凝活性。研宄發(fā)現(xiàn)CYP2C9存在多種基因多態(tài)性，目前發(fā)現(xiàn) 已超過60種，但最為常見的是CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3,其它的多態(tài)性則較為罕 見。CYP2C9*2(Argl44Cys)純合體是野生型CYP2C9*1純合體活性的16% -20%，白種人中 CYP2C9*2突變頻率高達(dá)11%，而在亞洲人群中則極為罕見；CYP2C9*3(Ile359Leu)純合體 活性僅為野生型純合體的4% -6%，在中國人中的突變頻率可達(dá)3. 3%。因此，與具有野生 型純合體的患者相比，攜帶這突變基因型的患者在服用華法林后，達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需的時間更 長，在同等給藥劑量時，INR值偏高，發(fā)生危及生命的出血風(fēng)險增大。VK0RC1 (維生素環(huán)氧化 物還原酶復(fù)合體亞基1)編碼含有163個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，是VK0RC(維生素環(huán)氧化物 還原酶復(fù)合體）的最重要的一個組成亞基，是凝血因子II、VE、IX、X以及蛋白C、S和Z活化 的必需因素，其中，VK0RC1不僅控制著維生素K依賴性凝血因子的生成，同時也是華法林作 用的靶點(diǎn)，VK0RC1啟動子區(qū)-1639區(qū)AA基因型攜帶者對發(fā)華林敏感，屬于高代謝型，僅需 服用較小劑量的華法林即可達(dá)到并維持INR目標(biāo)范圍，而-1639GG和-1639AG攜帶者則對 華法林相對不敏感，需要較大劑量華法林才可以達(dá)到預(yù)期的INR范圍。CYP2C9和VK0RC1兩 個基因的多態(tài)性與華法林的個體化治療最為密切相關(guān)，通過對目標(biāo)患者進(jìn)行基因檢測，確 定其基因類型，即可通過固定的公式計算或者按照FDA推薦的劑量服用華法林，短時間內(nèi) 即可達(dá)到臨床規(guī)定的INR值范圍。
[0004] 目前檢測CYP2C9和VK0RC1基因型的方法主要是直接測序法，另外也有高溫連接 酶法等。但這兩種方法都需要DNA測序儀配合使用，DNA測序儀價格昂貴，多為外國企業(yè)所 壟斷，不利于國內(nèi)基礎(chǔ)研宄和廣大醫(yī)療機(jī)構(gòu)的配備。此外，DNA測序儀對操作人員的要求很 高，需定期維護(hù)，相關(guān)操作人員必須進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)才能上崗，測試步驟繁瑣。直接測序法需 要PCR產(chǎn)物純化、測序引物設(shè)計、測序反應(yīng)PCR的純化、測序反應(yīng)化學(xué)類型選擇等等一系列 繁瑣又易出錯的步驟，不易推廣使用。且上述兩種方法測試時間較長，直接測序法最快八個 小時，高溫連接酶法最快要五個小時。
[0005]雙向等位基因特異性PCR(Bidirectional Allele-specific PCR，Bi_ASPCR)是等 位基因特異性PCR (Allele-specific PCR)的一種發(fā)展應(yīng)用，Bi-ASPCR采用四條引物，分別 是兩條外側(cè)引物和兩條等位基因特異性的內(nèi)側(cè)引物，在檢測時，每一條等位基因特異性的 引物配合一條外側(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可以同時從兩個方向檢測同一個位點(diǎn)，與此同時，兩條外 側(cè)引物還可以擴(kuò)增待測模板，作為陽性對照。因此，用Bi-ASPCR法檢測CYP2C9和VK0RC1， 對指導(dǎo)華法林用藥意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的檢測CYP2C9和VK0RC1基因型的方法成本較高，操 作復(fù)雜，需要的測試時間長。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的在于提供華法林個體化用藥檢測引物，其包括以下引物對：
[0008] (1) CYP2C9*2位點(diǎn)第一輪PCR
[0009]上游引物：5' -CTGTCTACTTTCCTAGCTCTCAAAGG-3' (SEQ ID No. 1)，
[0010]下游引物：5，-GATAGGGCCAITCCCACCATGITG-3' （SEQ ID No. 2);
[0011] (2) CYP2C9*2位點(diǎn)第二輪PCR
[0012]上游引物：5，-TTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAA-3，（SEQ ID No. 3)，
[0013]下游引物：5，-TGGGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3' （SEQ ID No. 4)，
[0014]突變型特異引物：5，-AAGAGGAGCATTGAGGCCT-3' (SEQ ID No. 5)，
[0015]野生型特異引物：5' -CGGGCTTCCTCTTGAACCCG-3' (SEQ ID No. 6);
[0016] (3) CYP2C9*3位點(diǎn)PCR
[0017]上游引物：5，-TCTGGITTATGGCAGTTACACA-3，（SEQ ID No. 7)，
[0018]下游引物：5' -GGGACTTCGAAAACATGGAGT-3' （SEQ ID No. 8)，
[0019]野生型特異引物：5' -GCACGAGGTCCAGAGATGCA-3' (SEQ ID No. 9)，
[0020]突變型特異引物：5，-GGTGGGGAGAAGSTCCAG-3，（SEQ ID No. 10);
[0021] (4)VK0RC1-1639位點(diǎn)第一輪PCR
[0022]上游引物：5' -ATTCATGCAGGGACATCTTTGGTG-3' (SEQ ID No. 11)，
[0023]下游引物：5，-TCCTCTCCCGGCATTATCCCATC-3，（SEQ ID No. 12);
[0024] (5) VK0RC1-1639位點(diǎn)第二輪PCR
[0025]上游引物：5，-CCAGCAGGAGAGGGAAATATCAC-3' （SEQ ID No. 13)，
[0026]下游引物：5，-ACCAAGAYGCTAGACCCAA-3，（SEQ ID No. 14)，VK0RC1-1639位點(diǎn)A 第二輪PCR特異引物：
[0027] 5，-GACCTGAAAAACAACCATTGGACA-3，（SEQ ID No. 15)，VK0RC1-1639位點(diǎn)G第二 輪PCR特異引物：
[0028] 5，-CGTGAGCCACCGCAACC-3，（SEQIDNo. 16)。
[0029] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種華法林個體化用藥檢測試劑盒。所述試劑盒包 括上述的引物。
[0030] 進(jìn)一步地，所述試劑盒中還包括PCR緩沖液，Taq酶，dNTP，DNAladder Marker。
[0031] 進(jìn)一步地，使用時，所述各引物的濃度均為10uM;dNTP為dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的混合物，所述dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為2. 5mM。
[0032] 本發(fā)明的第三個目的在于提供華法林個體化用藥檢測方法，其使用上述的試劑 盒，包括以下步驟：
[0033] (1)第一輪 PCR
[0034] 以待檢測的核酸為模板，分別對CYP2C9*2位點(diǎn)、CYP2C9*3位點(diǎn)和VK0RC1-1639位 點(diǎn)進(jìn)行第一輪PCR處理，得到的產(chǎn)物分別記為M、B和N;
[0035] (2)第二輪 PCR
[0036] 將M稀釋100倍后作為模板，對CYP2C9*2位點(diǎn)進(jìn)行第二輪PCR處理，其產(chǎn)物記為 A；
[0037] 以N稀釋100倍后作為模板，對VK0RC1-1639位點(diǎn)進(jìn)行第二輪PCR處理，其產(chǎn)物記 為C;
[0038] (3)電泳
[0039] 將步驟⑴中得到的B、步驟⑵中得到的A和C進(jìn)行凝膠電泳，將得到的電泳圖 與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照。
[0040] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中對CYP2C9*2位點(diǎn)、CYP2C9*3位點(diǎn)和VK0RC1-1639位點(diǎn) 進(jìn)行第一輪PCR處理的條件為：
[0041] (a) 95°C 下 4min;
[0042] (b)95°C下 30s，60°C下 15s，72°C下 30s，循環(huán) 35 次。
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