一種單一或多重目的基因片段恒溫擴增的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種擴增目的基因片段并對擴增結(jié)果進行檢測的方法，屬于分子生物 學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由 Notomi等建立的一種新的核酸特異性擴增技術(shù)，具有特異性強、靈敏高、操作簡單、產(chǎn)物易 檢測等優(yōu)點。該技術(shù)已被廣泛用于分子診斷領(lǐng)域。LAMP針對靶序列的6個特異部位設(shè) 計4條核心引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從 而使革巴序列高效擴增。4條核心引物之中2條為內(nèi)引物，即FIP(ForWardinnerprimer， FIP)和BIP(Backwardinnerprimer，BIP)。FIP包含F(xiàn)lc和F2(F2c區(qū)域的互補序列），即 5' -Flc-F2;BIP包含Blc(Bl區(qū)域的互補序列）和B2,即5' -Blc-B2。其余兩條核心引 物為外引物為F3和B3。另外的兩條環(huán)引物（Loopprimes,LF和LB)被增加到反應(yīng)體系中 加速LAMP反應(yīng)。
[0003]LAMP反應(yīng)包括兩個過程，即啞鈴狀模板合成階段和循環(huán)擴增階段。LAMP反應(yīng)的溫 度為60~65°C，該溫度是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，雙鏈DNA在該溫度范圍內(nèi)處于 半解離和半結(jié)合的動態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延 伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。在鏈置換BstDNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區(qū) 段的3'末端為起點，與對應(yīng)的DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前 端F3c序列互補，以3'末端為起點，通過鏈置換活性DNA聚合酶的作用，首先置換出FIP引 物合成的DNA鏈，同時合成自身DNA。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。 然而由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，該單鏈通過5'末端的 Flc區(qū)段和F1區(qū)段互補，發(fā)生自我堿基配對，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時，BIP引物同該單鏈雜交 結(jié)合，以BIP引物的3'端為起點，合成互補鏈，在此過程中莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開。接著，B3引物 與BIP引物外側(cè)的互補區(qū)域B3c配對結(jié)合，以3'端為起點，在聚合酶的作用下，合成新的互 補鏈。通過上述2個過程，形成雙鏈DNA。被置換的單鏈DNA依據(jù)兩端存在的互補區(qū)域，發(fā) 生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條被置換出來的DNA在兩端呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，該結(jié) 構(gòu)作為LAMP反應(yīng)擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)擴增循環(huán)階段：首先在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以 3'末端的F1區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。與此同時，F(xiàn)IP引物F2與環(huán) 上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應(yīng)，解離由F1區(qū)段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出 的單鏈核酸上也會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)上存在單鏈形式B2c，BIP引物上的B2與其 雜交，啟動新一輪擴增，經(jīng)過相同的過程，又形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過此過程，結(jié)果在同一條鏈上 互補序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)可以特異、高效、快速的擴增目的DNA， 在1小時之內(nèi)使產(chǎn)物的量達到1〇9個拷貝。
[0004]LAMP擴增之后，其產(chǎn)物的檢測可以通過瓊脂糖電泳后染色觀察。較為簡便的方法 是直接在產(chǎn)物中加入SYBRGreenI染色，呈現(xiàn)綠色為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。也可 以通過擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷，液體渾濁，離心或有白色沉淀的為陽性 反應(yīng)，無此現(xiàn)象的則為陰性反應(yīng)?，F(xiàn)在更為簡單的方法是在反應(yīng)混合物中加入可視染料，陽 性反應(yīng)管的顏色從淺灰色變?yōu)榫G色，陰性反應(yīng)管則保持原來的淺灰色。然而，這些方法都只 能檢測LAMP反應(yīng)是否進行，不能識別針對特定靶序列的特異性擴增，導(dǎo)致LAMP在檢測目的 序列時，其結(jié)果的判定缺乏特異性。因此，傳統(tǒng)LAMP檢測很難實現(xiàn)對多重目的片段的同時 檢測，這極大限制了LAMP的廣泛應(yīng)用。
[0005]鑒于上述問題，一些研宄致力于發(fā)展多重LAMP檢測技術(shù)。實現(xiàn)多重LAMP檢測最 常見的方法是在靶序列中尋找限制性內(nèi)切酶酶切位點，將LAMP產(chǎn)物運用限制性內(nèi)切酶消 化，通過電泳消化后的LAMP產(chǎn)物，根據(jù)不同的電泳條帶大小與相應(yīng)的靶序列對應(yīng)。然而，該 方法需要兩步完成，限制性內(nèi)切酶酶切片段大小各異的LAMP產(chǎn)物時，耗時較長且酶切不完 全，導(dǎo)致一條靶序列常常對應(yīng)了幾條電泳條帶，使得多重LAMP的結(jié)果難判斷。另一種實現(xiàn) 多重LAMP檢測的新技術(shù)是將LAMP擴增反應(yīng)和焦磷酸測序結(jié)合。然而，該方法與限制性內(nèi) 切酶介導(dǎo)的多重LAMP檢測技術(shù)一樣，都需要兩步完成，首先是LAMP擴增，然后通過焦磷酸 測序?qū)?yīng)到相應(yīng)的靶序列。該方法操作繁瑣，需要特定的試劑盒對LAMP產(chǎn)物進行純化，測 序過程需要特殊人員，以及普通實驗室無法負(fù)擔(dān)的測序儀和測序試劑。這些劣勢限制了該 方法的推廣使用。此外，現(xiàn)存的多重LAMP檢測技術(shù)都無法實現(xiàn)快速檢測，完成多重LAMP檢 測耗時大于2. 5小時。由于LAMP反應(yīng)的靈敏度極高，實行LAMP產(chǎn)物的開蓋操作對以后的 LAMP實驗存在極大的污染。
[0006]綜上，現(xiàn)有技術(shù)中的LAMP不論在單一擴增還是多重擴增的檢測上都存在著難以 克服的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是改進LAMP反應(yīng)的原理，以LAMP反應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶 切和熒光檢測原理，建立一種操作簡便、特異性強、靈敏度高、檢測速度快的一步法單一或 多重LAMP檢測，以便實現(xiàn)LAMP技術(shù)的廣泛使用。
[0008] 基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種擴增目的基因片段并對擴增結(jié)果進行檢測 的方法，所述方法包括以下步驟：
[0009] (1)自所述目的基因片段的3'端起，設(shè)定第一任意序列Flc，第二任意序列F2c和 第三任意序列F3c，自所述目的基因片段的5'端起，設(shè)定第四任意序列B1，第五任意序列B2 和第六任意序列B3 ;
[0010] ⑵提供引物EFIP，所述引物EFIP含有與序列F2c互補的序列F2,在所述序列F2 的5'端連接有與序列Flc相同的序列，在所述序列Flc5'端連接有一段限制性內(nèi)切酶識 別片段；提供引物EBIP，所述引物EBIP含有與序列B2相同的序列，在所述序列B2的5'端 連接有與序列B1互補的序列Blc，在所述序列Blc5'端連接有一段限制性內(nèi)切酶識別片 段；其中在引物EFIP和/或引物EBIP的5'端標(biāo)記有一熒光基團，在所述被標(biāo)記熒光基團 的引物中除所述限制性內(nèi)切酶片段以外的其它位置標(biāo)記有一熒光猝滅基團，所述熒光猝滅 基團能夠猝滅所述熒光基團；
[0011] (3)在鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物、所述限制性內(nèi)切酶和緩沖液存在 下，使用目的基因片段作為模板擴增DNA;
[0012] (4)檢測步驟⑶的擴增結(jié)果。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（4)所述的檢測為可視顏色變化檢測、電泳檢測、或?qū)崟r熒光檢測。
[0014] 步驟⑶所述鏈移位型聚合酶可以為BstDNA聚合酶、所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑可以 為甜菜堿。
[0015] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟（2)中所提供引物還包括含有與序列F3c互 補的引物F3,和含有與序列B3相同的引物B3。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中所提供引物還包括含有與Flc-F2c之間和Blc-B2c之間 序列互補的一對引物L(fēng)F和LB。
[0017] 步驟（2)中所述擴增可以在60~66°C中進行，在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟 (2)中所述擴增是在63~65°C中進行。
[0018] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述引物序列選自下列序列組合：
[0019] ⑴所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:4所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 5所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO: 1所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO: 2所 示，所述引物L(fēng)F的序列由SEQIDNO:6所示，所述引物L(fēng)B的序列由SEQIDNO:7所示；或 者
[0020] (2)所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:11所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 12所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO:8所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO:9 所示，所述引物L(fēng)F的序列由SEQIDNO: 13所示，所述引物L(fēng)B的序列由SEQIDNO: 14所示。
[0021] 在上述序列組合中，第（1)組組合用于Listeriamonocytogenes菌的檢測，第（2) 組組合用于Listeriaivanovii菌的檢測。
[0022] 優(yōu)選地，所述序列組合中引物EFIP序列SEQIDN0:4標(biāo)記的熒光基團為FAM，引物 EFIP序列SEQIDN0:11標(biāo)記的熒光基團為HEX。
[0023] 在本發(fā)明另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明方法可以使用一種或多種以上的步驟 ⑵所述引物一次擴增相對應(yīng)的目的基因片段并進行檢測，其中，與每一種目的基因片段相 匹配的引物上所標(biāo)記的熒光基團是不同的，并在步驟（4)的檢測中顯示出差異性的結(jié)果。
[0024] 優(yōu)選地，所述引物序列為下列序列組合：
[0025] ⑴所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:4所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 5所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO: 1所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO: 2所 示，所述引物L(fēng)F的序列由SEQIDNO:6所示，所述引物L(fēng)B的序列由SEQIDNO:7所示；以 及
[0026] (2)所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:11所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 12所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO:8所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO:9 所示，所述引物L(fēng)F的序列由SEQIDNO: 13所示，所述引物L(fēng)B的序列由SEQIDNO: 14所示。
[0027] 在上述序列組合中，第（1)組組合用于Listeriamonocytogenes菌的檢測，第（2) 組組合用于Listeriaivanovii菌的檢測，其中兩種序列組合中所述引物EFIP序列SEQID N0:4標(biāo)記的熒光基團為FAM，引物EFIP序列SEQIDNO: 11標(biāo)記的熒光基團為HEX。
[0028] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于擴增目的基因片段并對擴增結(jié)果進行檢測的 試劑盒，所述試劑盒包括：
[0029] (1)自所述目的基因片段的3'端起，設(shè)定第一任意序列Flc，第二任意序列F2c和 第三任意序列F3c，自所述目的基因片段的5'端起，設(shè)定第四任意序列B1，第五任意序列B2 和第六任意序列B3時，提供引物EFIP，所述引物EFIP含有與序列F2c互補的序列F2,在