使用Chromas2軟件進行序列比較和分析。
[0084] 12、Sanger測序結(jié)果的分析與處理：在"乳腺癌病例"組和"健康對照"組中發(fā)現(xiàn) 有1例患者存在BRCA1基因的基因組序列41256139位置T堿基缺失導(dǎo)致發(fā)生移碼突變。
[0085] 實施例3單個突變位點的Sanger測序基因分型
[0086] 將上述Sanger測序掃描發(fā)現(xiàn)與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的突變位點在3000例病理學明確 診斷的無家族史散發(fā)型中國漢族女性乳腺癌患者和3000例無腫瘤家族史，與病例年齡匹 配的中國漢族女性健康女性對照中進行檢測，具體步驟為：
[0087] 1、向儲存于2ml凍存管中的白細胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0088] 2、去除紅細胞：用溶血試劑將5ml離心管補至4ml，顛倒混勾，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0089] 3、抽提DNA:向沉淀中加1ml抽提液和8yl蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻， 37 °C水浴過夜。
[0090] 4、去除蛋白質(zhì)：加1ml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1)，充分混勾后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入兩個1. 5ml 的離心管）。
[0091] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60y1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心10min。
[0092] 6、DNA洗滌：在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心10min，棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0093] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/y1DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0094] 8、采用Sanger測序平臺對于發(fā)生突變的外顯子進行基因分型。對Sanger測序掃 描發(fā)現(xiàn)與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的突變位點設(shè)計特異性引物（表1)。
[0095] 9、PCR反應(yīng)體系30微升，包括：模板50ng;引物F: 1微升和引物R: 1微升；2XMIX 15微升；H20補足至30微升。
[0096] 10、PCR反應(yīng)程序：95°C5min ; (95°C30s;56°C30s;72°C30s)X40 個循環(huán)； 72°C6min ;4°C保存。
[0097] 11、采用ABI3730平臺進行Sanger測序；
[0098] 12、使用Chromas2軟件進行序列比較和分析，在3000例中國漢族散發(fā)性乳腺癌患 者中，存在5例患者攜帶該突變；在3000例正常人群中，未發(fā)現(xiàn)突變個體。
[0099] 因此，本發(fā)明人證明了采用BRCA1基因g. 41256139delT移碼突變能夠很好地將健 康對照和乳腺癌患者區(qū)分。
[0100] 實施例4全人群隊列樣本中單個突變位點的Sanger測序基因分型
[0101] 將上述Sanger測序掃描發(fā)現(xiàn)與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的突變位點在2004年建立的全人 群隊列中的女性7120例進行檢測，具體步驟為：
[0102] 1、向儲存于2ml凍存管中的白細胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0103] 2、去除紅細胞：用溶血試劑將5ml離心管補至4ml，顛倒混勾，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0104] 3、抽提DNA:向沉淀中加1ml抽提液和8yl蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻， 37 °C水浴過夜。
[0105] 4、去除蛋白質(zhì)：加1ml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1)，充分混勾后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入兩個1. 5ml 的離心管）。
[0106] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60y1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0107] 6、DNA洗絳：在沉淀中加入冰無水乙醇1ml, 12000rpm離心lOmin,棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0108] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/y1DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0109] 8、采用Sanger測序平臺對于發(fā)生突變的外顯子進行基因分型。對Sanger測序掃 描發(fā)現(xiàn)與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的突變位點設(shè)計特異性引物（表1)。
[0110] 9、PCR反應(yīng)體系30微升，包括：模板50ng;引物F: 1微升和引物R: 1微升；2XMIX 15微升；H20補足至30微升。
[0111] 10、PCR反應(yīng)程序：95°C5min;(95°C30s;56°C30s;72°C30s)X40 個循環(huán)； 72°C6min;4°C保存。
[0112] 11、采用ABI3730平臺進行Sanger測序；
[0113] 12、使用Chromas2軟件進行序列比較和分析，我們在2004年建立的中國漢族正常 人群隊列（排除任何腫瘤患者，排除乳腺癌家族史患者）中女性7120名（36歲-70歲）檢 測該突變，發(fā)現(xiàn)突變陽性1例（基線時為57歲），隨訪至2013年，共發(fā)生25例新發(fā)乳腺癌 患者，其中包含該突變陽性者。
[0114] 因此，本發(fā)明人證明了采用BRCA1基因g. 41256139delT移碼突變能夠很好地將健 康對照和乳腺癌患者區(qū)分。
[0115] 實施例5用于乳腺癌輔助診斷突變位點試劑盒的制作
[0116] 突變位點試劑盒的制作和操作流程是基于Sanger測序掃描檢測分型技術(shù)。試劑 盒含有一批突變位點特異性引物（包括下列引物：g.41256139delT突變位點的引物序列為 SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4)，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、MgCl2溶液、去離子水等；這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以含 有標準品和/或?qū)φ掌罚ㄈ绱_定基因型的標準品和空白對照等）。此試劑盒的價值在于只 需要外周血而不需要其它組織樣品，通過最精簡和特異的引物對檢測突變位點，再通過突 變位點譜輔助判斷乳腺癌，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特 異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個體化治療。
[0117] 表1.相關(guān)突變位點引物和探針信息
【主權(quán)項】
1. 一種用于乳腺癌輔助診斷的BRCAl突變基因，其特征在于該突變基因與BRCAl正常 基因序列相比具有g(shù). 41256139delT位點移碼突變。2. 用于檢測權(quán)利要求1所述BRCAl基因的突變位點的特異性測序引物，其特征在于上 游引物的序列如為SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。3. 用于檢測權(quán)利要求1所述BRCAl基因的檢測方法，其特征在于：采用Sanger測序方 法，使用PCR擴增引物，對BRCAl基因進行突變檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增引物的上游引物的序 列如為SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。5. 權(quán)利要求1所述的BRCAl突變基因在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求2所述的引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。7. -種乳腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測BRCAl基因是否具有 g. 41256139delT位點移碼突變。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的引物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還含有PCR技術(shù)所需的常用試 劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學領(lǐng)域，公開了BRCA1基因g.41256139delT移碼突變及其在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用。該BRCA1基因突變與BRCA1正?；蛐蛄邢啾染哂術(shù).41256139delT位點移碼突變。本發(fā)明提供了乳腺癌致病的新的突變位點，可用于早期診斷乳腺癌。
【IPC分類】C12N15/12, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104962612
【申請?zhí)枴緾N201510296653
【發(fā)明人】胡志斌, 劉曉安, 沈洪兵, 江玥, 李沁, 聞洋
【申請人】南京醫(yī)科大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年6月2日