一種檢測(cè)hla-b*13:01等位基因的多重實(shí)時(shí)熒光pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物基因分析領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)HLA-B*13:01等位基因的特異 性引物及探針設(shè)計(jì)，以及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麻風(fēng)病是一種由分歧桿菌引起的一種慢性的具有較低傳染性的疾病。主要累及皮 膚及外周神經(jīng)，嚴(yán)重者可致容貌毀損和肢體畸殘。世界衛(wèi)生組織曾提出在上世紀(jì)末全球消 滅麻風(fēng)的宏偉計(jì)劃，雖然取得了相當(dāng)顯著的成績(jī)，但至今麻風(fēng)仍是一個(gè)重要的公共健康問 題。麻風(fēng)在世界上流行已接近3000年，印度、埃及和中國(guó)被認(rèn)為是世界三大麻風(fēng)疫源地。在 我國(guó)，麻風(fēng)已經(jīng)流行了兩千多年，20世紀(jì)40年代初應(yīng)用砜類藥物治療麻風(fēng)證明有效后，使 麻風(fēng)的治療進(jìn)入了化學(xué)治療的年代，在幾十年的臨床實(shí)踐中，又相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)種有效的抗 麻風(fēng)藥物。過去曾用單一藥物治療，療期很長(zhǎng)，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有耐藥病例出現(xiàn)，而且耐藥發(fā) 生率在不斷增加，說明單一藥物治療麻風(fēng)病不夠理想。因此，世界衛(wèi)生組織根據(jù)結(jié)核病化療 的經(jīng)驗(yàn)和馬耳他采用多種藥物聯(lián)合化療治療麻風(fēng)病的經(jīng)驗(yàn)，于1982年推薦用MDT方案治療 麻風(fēng)病，使麻風(fēng)病的治療又發(fā)展到一個(gè)一個(gè)新的階段，即從單一藥物治療轉(zhuǎn)入多種藥物化 療，使麻風(fēng)病的治療期縮短了不少。聯(lián)合化療的藥物通用的有3種，即氨苯砜、利福平和氯 法齊明。但是，據(jù)報(bào)道有大約2%的麻風(fēng)患者在服用氨苯砜后會(huì)出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，其中致 死率高達(dá)12.5%。通常在臨床上診斷氨苯砜過敏綜合征（DIHR)的標(biāo)準(zhǔn)有發(fā)熱、皮瘆、淋巴 結(jié)病和肝炎，氨苯砜過敏綜合征通常還伴隨著低血紅蛋白癥、膽汁阻塞及肝功能疾病。
[0003] 人類主要組織相容性復(fù)合體（HLA)，是迄今為止人類多態(tài)性最高的區(qū)域之一，HLA 定位于人類第6號(hào)染色體的短臂6p21. 3,是一群緊密連鎖的復(fù)等位基因群。包括220多個(gè) 基因，總長(zhǎng)度達(dá)到3600kb，約占人類基因組總長(zhǎng)度的1/3000。HLA在人類的免疫調(diào)節(jié)中起著 非常重要的作用。其中，I類基因（HLA-A，HLA-B，和HLA-C)以及II類基因（HLA-DR，HLA-DQ， 和HLA-DP)與抗原傳遞的調(diào)節(jié)有關(guān)，并且在免疫系統(tǒng)的肽呈遞上起著重要的作用。1973 年，Brewerton等人研宄結(jié)果表明HLA-B*27與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。 2004年Chung等的研宄發(fā)現(xiàn)了HLA-B*15:02與卡馬西平用藥所引起的史蒂文森-綜合征有 關(guān)。越來越多的結(jié)果表明HLA等位基因和一些藥物引發(fā)的過敏性炎癥有關(guān)，并且在2012年 Nicholas等的研宄表明HLA-B*13:01與氨苯砜用藥所引起的氨苯砜過敏綜合征（DIHR)有 明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。因此，在對(duì)病人進(jìn)行氨苯砜用藥之前進(jìn)行HLA-B*13:01等位基因的篩 查是非常有意義的。
[0004] 目前，HLA等位基因分型檢測(cè)的常用方法主要是基于核酸序列識(shí)別的方法，主要包 括PCR-SBT(基于測(cè)序分型的聚合酶鏈反應(yīng)），PCR-SS0P(序列特異性寡核苷酸探針分型） 和PCR-SSP(序列特異性引導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。
[0005] 其中PCR-SBT法是對(duì)于HLA等位基因進(jìn)行測(cè)序，從而確定具體的HLA等位基因亞 型，但其檢測(cè)的操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高昂，而且測(cè)序結(jié)果會(huì)出現(xiàn)套峰，不適合對(duì)于臨床樣 本的快速指導(dǎo)。PCR-SSP技術(shù)則需要進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)、PCR后處理，因此該技術(shù)在操作過 程中易造成二次污染、時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)在PCR過程中多對(duì)引物易造成二聚體等非目的基因產(chǎn) 物，從而造成假陽(yáng)性結(jié)果。目前基于RT-PCR方法檢測(cè)HLA-B*13:01等位基因的試劑盒較少， 而且操作繁瑣，要多管反應(yīng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和污染，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速、簡(jiǎn)便、高特異性檢 測(cè)HLA-B*13:01等位基因的需求。
[0006] 目前已知HLA-B等位基因的亞型已達(dá)到3600多種，基于HLA等位基因的多態(tài)性， 在設(shè)計(jì)HLA-B*13:01等位基因特異性引物和探針之前，必須將HLA-B*13:01等位基因序列 與HLA-B其他等位基因序列進(jìn)行比對(duì)，其中將HLA-B*07:02:01等位基因作為基礎(chǔ)序列參 照。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HLA-B*13:01與多個(gè)HLA-B等位基因都具有很高的同源性，尤 其是HLA-B* 13系列的等位基因，而這些針對(duì)HLA-B* 13:01等位基因特異性的位點(diǎn)分布在多 個(gè)外顯子和內(nèi)含子區(qū)域中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明研發(fā)出兩套適宜于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增HLA-B*13:01等位基因 的引物和探針組合；在已有的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HLA等位基因的基礎(chǔ)上，提供了一種更加快 速、簡(jiǎn)便、高通量、高特異性并且穩(wěn)定檢測(cè)HLA-B*13:01等位基因的方法。這樣，能夠?yàn)槁轱L(fēng) 患者服用氨苯砜后出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)的可能性的判斷提供有意義的參考，有利于氨苯 砜的個(gè)體化用藥。
[0008] 本發(fā)明通過比對(duì)HLA-B的等位基因序列發(fā)現(xiàn)HLA-B*13:01相對(duì)于其他HLA-B等位 基因的特異性位點(diǎn)，主要在Intron2、Exon3和Intron5上。為了保證HLA_B*13:01等位基 因檢測(cè)的特異性，至少需要設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物和探針，其中第一對(duì)特異性引物和探針分 布在內(nèi)含子2和外顯子3具有特異性位點(diǎn)的區(qū)域上，第二對(duì)特異性引物和探針分布在內(nèi)含 子5具有特異性位點(diǎn)的區(qū)域上，將兩對(duì)特異性的引物和探針放置在同一反應(yīng)管中進(jìn)行PCR 反應(yīng)，最終擴(kuò)增出來的HLA等位基因只有HLA-B*13:01。因此，檢測(cè)待測(cè)樣本時(shí)，當(dāng)同時(shí)出現(xiàn) 第一對(duì)和第二對(duì)特異性引物、探針的擴(kuò)增曲線時(shí)，說明此樣本攜帶HLA-B*13:01等位基因。
[0009] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的HLA-B*13:01特異性的引物探針組合包括：
[0010] 第一條上游引物F1 :5'-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3'（序列 1)
[0011]第一條下游引物R1 :5'-TCCTTGCCGTCGTAGGCT-3'（序列2)
[0012] 探針Probel:5'-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG-BHQ2-3'（序列 5)
[0013] 其中，HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein ;BHQ2為Black Hole Quencher-2〇
[0014]第二條上游引物F2:5'-CACAGGGGCTAACGCAGA-3'（序列3)
[0015]第二條下游引物R2 :5' -CCCAACACCACAACCATCAAG-3'（序列 4)
[0016]探針Probe2 :5'-CY5-ATACATCCGTGCTTCAITGTCAC-BHQ2-3'（序列6)
[0017] 其中CY5為：Cyaine5
[0018] 一種檢測(cè)HLA_B*13:01等位基因TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，主要包括以下環(huán) T：
[0019] (1)針對(duì)HLA_B*13:01特異性的引物和探針組合，即權(quán)利要求1所述的引物和探 針：并設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物和探針：
[0020]⑵獲得抽提的待測(cè)樣本基因組DNA;
[0021] (3)在同一個(gè)反應(yīng)體系中將待測(cè)樣本基因組DNA與HLA-B*13:01特異性的引物和 探針以及內(nèi)參基因的引物和探針按一定的比例混合；
[0022] (4)通過AppliedBiosystem7500 或者LightCyclerSystem480 進(jìn)行實(shí)時(shí)焚光 PCR檢測(cè)，其中分別利用FAM、HEX/VIC和CY5通道進(jìn)行三通道熒光采集；
[0023] (5)分析判斷待測(cè)樣本是否攜帶HLA-B*13:01等位基因。
[0024] 基于以上方案，本發(fā)明還做了如下優(yōu)化：
[0025] 環(huán)節(jié)（1)中內(nèi)參基因ACTB的引物和探針為：
[0026]上游引物F :5' -CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'（序列7)
[0027]下游引物R :5' -GCAITTGCGGTGGACGAT-3'（序列8)
[0028]探針Probe :5' -FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-TAMRA-3'（序列9)
[0029] 使用PremixExTaq試劑盒（TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)體系以20yL計(jì)，貝丨J包 括：10yLPremixExTaq(2X)，HLA-B*13:01 特異性第一條上游引物FI:125nM，第一條下 游引物Rl:125nM，第一條特異性探針probel:100nM。第二條上游引物F2:125nM，第二條 下游引物R2 :125nM，第二條特異性探針probe2:100nM，以及ACTB基因特異性的上游引物 250nM，下游引物250nM及其對(duì)應(yīng)的探針100nM，最后用水補(bǔ)充到20yL最終體積。擴(kuò)增程 序：95°C預(yù)變性 30s，95°C5s~lOsec, 64°C34s~40s，共計(jì) 35 ~40 個(gè)循環(huán)。
[0030] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有：
[0031] 1、節(jié)省耗材和時(shí)間、簡(jiǎn)單易行、高通量
[0032] 本發(fā)明將目的基因與內(nèi)參基因的引物和探針放置在同一反應(yīng)管中進(jìn)行反應(yīng)，在很 大程度上節(jié)省時(shí)間及實(shí)驗(yàn)耗材，整個(gè)檢測(cè)過程可在2小時(shí)內(nèi)全部完成。將本發(fā)明與HLA等 位基因分型的"金標(biāo)準(zhǔn)"PCR-SBT測(cè)序法進(jìn)行方法學(xué)的對(duì)比，100例樣本結(jié)果完全吻合。同 時(shí)使用本發(fā)明可一次同時(shí)高通量進(jìn)行96例或384例樣本進(jìn)行檢測(cè)，因此，可完全使用本發(fā) 明進(jìn)行HLA-B*13:01的檢測(cè)，適用于臨床分子診斷。
[0033] 2、結(jié)果可靠、靈敏度高
[0034] 只需10ng-20ng基因組DNA便可進(jìn)行準(zhǔn)確的HLA-B*13:01基因分型檢測(cè)，相比與 傳統(tǒng)的PCR-SSP技術(shù)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。其中，最低檢測(cè)樣本量可達(dá)到0. 08ng。
[0035] 3、檢測(cè)方法靈活、無污染
[0036] 本發(fā)明方法較傳統(tǒng)的HLA等位基因分型方法，未涉及多重?cái)U(kuò)增、重復(fù)開蓋等二次 污染的可能。本發(fā)明可直接根據(jù)探針的熒光曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物，不涉及任何對(duì)人體有毒害 作用的化學(xué)試劑，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、安全、無污染。
[0037] 4、成本低、經(jīng)濟(jì)適用
[0038] 由于本發(fā)明具有高通量的特點(diǎn)，因此使得本發(fā)明中每個(gè)反應(yīng)管的成本低；同時(shí)，此 技術(shù)適用于檢測(cè)人類全血、組織等全基因組DNA樣本，用以判斷麻風(fēng)患者服用氨苯砜后出 現(xiàn)嚴(yán)重過敏綜合反應(yīng)的概率，較經(jīng)濟(jì)適用。
【附圖說明】
[0039] 圖1為利用內(nèi)參基因（Target3)的引物與探針對(duì)人基因組DNA實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果。 FAM-1為陽(yáng)性樣本（攜帶HLA-B*13:01等位基因）；FAM-2為陰性樣本（不攜帶HLA-B*13:01 等位基因）；NTC表明此實(shí)驗(yàn)無污染；本圖說明此發(fā)明所用的陽(yáng)性樣本和陰性樣本質(zhì)量可 與巨o
[0040] 圖2為分別利用HEX/VIC和CY5通道進(jìn)行熒光采集的實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果，其中 HLA-B*13:Olprobel為HEX/VIC熒光通道所進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果；HLA-B*13:01probe2為CY5熒 光通道所進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果；NTC擴(kuò)增曲線表明實(shí)驗(yàn)無污染。
[0041] 圖3為利用FAM通道、HEX/CY5通道和VIC通道進(jìn)行多通道熒光采集的實(shí)時(shí)擴(kuò)增 結(jié)果。其中FAM-1、HEX/VIC-1、CY5-1為陽(yáng)性樣本的擴(kuò)增曲線；FAM-2、HEX/VIC-2、CY5-2為 陰性樣本的擴(kuò)增曲線；NTC擴(kuò)增曲線表明此實(shí)驗(yàn)無污染。
[0042] 圖4為HLA-B*13:01標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣本DNA系列稀釋后實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，樣本系列稀 釋倍數(shù)分別為 1:5 (10ng/yL)，1:25 (2ng/yL)，1:125 (0? 4ng/yL)，1:625 (0? 08ng/yL)， 1:3125(0. 016ng);。其中未攜帶HLA-B*13:01等位基因的陰性樣本及NTC在靈敏度檢測(cè) 反應(yīng)中作為對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明將實(shí)時(shí)定量PCR與擴(kuò)大阻滯突變系統(tǒng)ARMS(Amplificationrefractory mutationsystem)結(jié)合起來，針對(duì)HLA_B*13:01區(qū)別于其它HLA-B等位基因的特異性位 點(diǎn)，分別在Intron2、Exon3以及Intron5上設(shè)計(jì)引物和探針，值得注意的是，這兩組特異