二萜內(nèi)酯化合物,含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從小豆蔻中分離得到的一種新的二萜內(nèi)酯化 合物（I )，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物小豆蔻為多年生草本。根莖粗壯，棕紅色。葉兩列，葉片狹長披針狀，葉鞘具 棕黃色柔毛。穗狀花序由莖基部抽出?；ㄐ蝻@著伸長，花排列稀疏，花冠白色。果實(shí)長卵圓 形，果皮質(zhì)韌，不易開裂。種子團(tuán)分3瓣，每瓣種子5~9枚，種子氣味芳香而峻烈。主產(chǎn)越 南、斯里蘭卡和印度南部的馬拉巴（Malabar)海岸。實(shí)成熟時(shí)收采，除去殘留的果柄，曬干。 使用部分為姜科植物小豆蔻的干燥果實(shí)。
[0003] 藥材小豆蔻為姜科植物小豆蔻Elettaria cardamomum(L. ) Maton的干燥近成熟果 實(shí)，是藏醫(yī)與維吾爾醫(yī)用藥，以"加素"之名始載于《四部醫(yī)典》，現(xiàn)被多國藥典收載。小豆蔻 是世界著名的植物藥與香料，被稱為"香料之后"，原產(chǎn)于印度南部、斯里蘭卡及瓜地馬拉等 地，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用歷史超過兩千年，具有祛風(fēng)、健胃的功效。目前中醫(yī)很少使用，小 豆蔻曾以"豆蔻"之名收載于1953年版中國藥典。
[0004] 小豆蔻已報(bào)道的成分主要為揮發(fā)油，以及多糖與蛋白質(zhì)，推測還含有黃酮類化合 物，但目前尚未見黃酮類成分單體的分離與鑒定。揮發(fā)油是小豆蔻中重要的活性成分，含量 高達(dá)7%，超聲提取得到的揮發(fā)油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳 樟酯為主，與超臨界CO2提取所得成分類似；如以正己烷提取，揮發(fā)油組分有所不同，為檸檬 烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，還含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香檜 烯等。
[0005] 小豆蔻藥理活性多樣，尤以抗腫瘤活性報(bào)道最多，涉及皮膚、肺、結(jié)腸等多個(gè)部位 的腫瘤，對(duì)胃腸道也有較好的保護(hù)作用，此外，還具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從小豆蔻中分離得到的一種新的二萜內(nèi)酯化合物 (I )，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I ):
[0009]
[0010] 所述的藥物組合物，其中含有治療有效量的化合物（I )和藥學(xué)上可接受的載體。
[0011] 所述的化合物（I )的制備方法，具體操作步驟如下：(a)將小豆蔻粉碎，用85% 乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇 萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)將步驟（a)所得乙酸 乙酯萃取物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1、5:1和1:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（c)將.步驟（b)所得組分2用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用 體積比為30:1、25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)將步驟 (c)所得組分3用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，依次用體積百分濃度為40%、50%和 60 %的甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫5個(gè)柱體積，60 %甲醇水洗脫部位濃縮即得到 純的化合物（I )。
[0012] 所述的化合物（I )在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的組合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物 組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物I，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和 惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0015] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0016] 說明書附圖
[0017] 圖1為化合物（I )結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0019] 1、化學(xué)試劑：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷和甲醇，均為分析純，購自 南京化學(xué)試劑有限公司。
[0020] 2、材料和儀器：
[0021] 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，購于賽爾試劑公司；化合物I自制，歸一化純度大于 98% ;CTX(環(huán)磷酰胺，陽性藥）、胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜（DMSO)、瓊脂糖、冰醋酸購于 美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖溶液購于美國GIBCO公司；胎牛血清 購于山東銀香偉業(yè)公司；臺(tái)盼藍(lán)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自 凱基生物科技發(fā)展有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；甲醛購自美國 Fisher公司；過氧化氫酶購自天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心。
[0022] WD-9403C紫外分析儀購自德國Biometra公司；RKI-1002型二氧化碳培養(yǎng)箱購自 日本Ikemoto公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超速離心機(jī)購自北京醫(yī) 療器械廠；低速離心機(jī)購自北京醫(yī)療器械廠；Wilovert S型倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；壓力蒸汽滅菌器購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫金屬水浴箱購自杭州奧盛儀器有 限公司；恒溫磁力攪拌器購自天津勞爾科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板購自上海精密儀器公 司；超純水器購自英國PURELAB ulTRAGENETIC。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] (a)小豆蔻粉碎（8. 5Kg)，用85%乙醇熱回流提取，提取三次，每次25L溶劑，每次 提取2小時(shí)，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚（2LX3)、乙酸乙酯（2LX3)和水 飽和的正丁醇（2LX3)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（232g)和正丁醇萃 取物；(b)將步驟（a)所得乙酸乙酯萃取物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、 10:1、5:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（c)將步驟（b)所得組分2 (46g) 用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為30:1、25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個(gè)組分；（d)將步驟（c)所得組分3(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 依次用體積百分濃度為40%、50%和60%的甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫5個(gè)柱體 積，60%甲醇水洗脫部位濃縮得到純的化合物I (19mg)。
[0025] 結(jié)構(gòu)確證：白色針狀的結(jié)晶，易溶于氯仿、丙酮和甲醇，難溶于水；HR-ESMS 顯示[M+Na] +為m/z 353. 1716,結(jié)合核磁特征可得分子式為C 2(IH2604。核磁共振氫譜 數(shù)據(jù) δ H(ppm, CDCl3, 600MHz) :1. 64(1H，dd，1-Ha)，I. 39(1H，dd，1-Hb)，3. 24(1H，m， 2-H)，3. 04(1H，d，3-H)，I. 20(1H，dd，5-H)，2. 35(1H，dd，6-Ha)，2. 10(1H，dd，6-Hb)， 2. 00 (2H，t，n-H)，2. 00 (2H，t，12-H)，7. 41 (1H，t，14-H)，4. 91 (2H，d，15-H)，2. 13 (3H， s，17-H)，(λ 89 (3H，s，18-H)，(λ 89 (3H，s，19-H)，L 24 (3H，s，20-H);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) δ c(ppm，CDCl3, 150MHz) :35. I (CH2a_C)，52· 7(CH，2-C)，69· 6(CH，3-C)，37· 0(C，4-C)， 45. I (CH，5-C)，30. 2 (CH2,6-C)，123. O (C，7-C)，197. O (C，8-C)，181. 6 (C，9-C)，41. 7 (C， 10-C)，25. 5(CH2,11-C)，24. 9(CH2,12-C)，133. 8(C，13-C)，144. 7(CH，14-C)，70. 2(CH2， 15-C)，174. I (C，16-C)，29. 8 (CH3, 17-C)，25. 3 (CH3, 18-C)，25. 3 (CH3, 19-C)，19. 0 (CH3， 20-C);碳原子標(biāo)記參見附圖1。
[0026] 實(shí)施例2 :
[0027] 1、胃癌細(xì)胞SGC-7901的培養(yǎng)
[0028] I. 1細(xì)胞復(fù)蘇
[0029] (1)從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速置于37°C -42°C，75%酒精中，然后移至同 溫水浴鍋中；（2)輕輕晃動(dòng)l-3min凍存管，使凍存液融化，迅速移至超凈臺(tái)中；（3)將含有 細(xì)胞的凍存液吸入無菌離心管，加入適量RP頂-1640培養(yǎng)基；（4)吹打混勻后放入低速離心 機(jī)，800rpm/min離心3分鐘，去除上清液；(5)加入適量培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液依據(jù)濃度接 種到IOmL培養(yǎng)皿中；（6)置于含5%二氧化碳、37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0030] 1. 2細(xì)胞傳代
[0031] (1)待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞貼壁約80%時(shí)，在超凈臺(tái)中用移液管吸取舊的培養(yǎng)基吹打 數(shù)次培養(yǎng)皿中細(xì)胞，以吹掉死亡細(xì)胞；（2)用移液管吸去舊培養(yǎng)基，加入適量0. 25%胰酶消 化細(xì)胞，置于30°C培養(yǎng)箱中消化；（3)約3min后將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞周 邊發(fā)亮、回縮變圓后則說明細(xì)胞已經(jīng)從壁上脫離；⑷迅速于超凈臺(tái)中吸去胰酶。加入適量 培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿；（5)將細(xì)胞懸液按濃度分別接種至不同的 培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基；(6)重新置于含5% C02、37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0032] 2、細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0033] (1)準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋玻片，二者均用酒精擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板 上；（2)待酒精揮發(fā)后，吸出適量細(xì)胞懸液，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù) 板之間，注意不要溢出蓋玻片及兩側(cè)的玻璃槽，靜置后計(jì)數(shù)；(3)在顯微鏡下找到4個(gè)大格， 每個(gè)大格又分為16個(gè)小格，分別計(jì)數(shù)4個(gè)大格中的細(xì)胞數(shù)，取平均值。壓線細(xì)胞計(jì)左側(cè)和 上方的，不計(jì)右側(cè)和下方的；(4)細(xì)胞濃度（個(gè)/mL)=每個(gè)方格的平均細(xì)胞數(shù)X 10000 ; (5) 將細(xì)胞懸液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。
[0034] 3、細(xì)胞活力測定
[0035] (1)取待測定的SGC