一種用于蛋白質(zhì)表達(dá)的信號(hào)肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)(如抗體）在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽。 技術(shù)背景
[0002] 2007年我國基因重組蛋白類藥物取得較快發(fā)展，在基因組技術(shù)的上游階段，利用 大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合新的融合蛋白載體的構(gòu)建，有效的提高現(xiàn)有重組蛋白 藥物的半衰期和可溶性等特性，為工業(yè)化制備提供了新的工藝，從而提高了重組蛋白的回 收率；但在下游的分離純化技術(shù)和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)和純化能力方面，仍存在較大 差距。特別是現(xiàn)代生物醫(yī)藥的重要組成部分--抗體，抗體針對相應(yīng)抗原具有高特異性和 高親和力的特性，使得其在疾病的診斷和治療中顯示出其他類型藥物無可比擬的優(yōu)勢?？?體藥物經(jīng)歷了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體的發(fā)展，抗體藥物向低抗原 性、高特異性方向發(fā)展?？贵w制備方法經(jīng)歷了常規(guī)血清技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、基因工程抗體技 術(shù)及抗體庫技術(shù)。使用體外篩選技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選獲得全人源抗體成為抗體研究的主 要方向。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體）成為蛋白質(zhì)生產(chǎn)的主流，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞 外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率，降低生產(chǎn)成本 是當(dāng)前工作中的重中之重。
[0003] 工業(yè)上，蛋白質(zhì)(如抗體）的表達(dá)水平受很多因素影響，如表達(dá)載體、宿主、培養(yǎng)基、 培養(yǎng)工藝等。而表達(dá)載體的表達(dá)能力又受啟動(dòng)子、信號(hào)肽等因素影響，其中信號(hào)肽在蛋白質(zhì) (如抗體）的分泌表達(dá)過程中扮演著至關(guān)重要的作用，直接影響分泌蛋白質(zhì)的質(zhì)量。
[0004] 信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端。一般由15~30個(gè)氨基酸組成。包括三個(gè)區(qū)：一個(gè)帶 正電的N末端，稱為堿性氨基末端；一個(gè)中間疏水序列，以中性氨基酸為主，能夠形成一段 α螺旋結(jié)構(gòu)，它是信號(hào)肽的主要功能區(qū)；一個(gè)較長的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸， 是信號(hào)序列切割位點(diǎn)，也稱加工區(qū)。當(dāng)信號(hào)肽序列合成后，被信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP)所識(shí)別， 蛋白質(zhì)合成暫?；驕p緩，信號(hào)識(shí)別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，蛋白質(zhì)合成重新開始。在 信號(hào)肽的引導(dǎo)下，
[0005] 新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而信號(hào)肽序列則在信號(hào)肽酶的作用下被切除。信 號(hào)肽分泌外源蛋白的作用如下：
[0006] 1)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞。
[0007] 2)信號(hào)肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率。
[0008] 3)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細(xì)胞器進(jìn)行正確的定位。
[0009] 4)信號(hào)肽能夠分泌增強(qiáng)子增強(qiáng)外源蛋白的分泌。
[0010] 5)短的信號(hào)欣有利于減少表達(dá)載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因 表達(dá)盒的
[0011] 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。
[0012] 同一種蛋白在不同信號(hào)肽的作用下，即使都能分泌表達(dá)，其分泌效率也會(huì)相差甚 遠(yuǎn)。如Nagarajan選擇了枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢桿菌RNA酶（barnase)和果聚 糖蔗糖酶等4種酶的信號(hào)肽，以芽孢桿菌BE1510為宿主菌，分別研究它們對重組鏈霉抗生 物素蛋白（stre ptavidin)分泌效果的影響。結(jié)果表明，攜帶4種融合基因的菌株都能有 效分泌四聚體鏈霉抗生物素蛋白，但以用中性蛋白酶信號(hào)肽時(shí)效率最高。適當(dāng)改造信號(hào)肽 結(jié)構(gòu)可提高外源蛋白的分泌效率。對于外源蛋白（如抗體)，選擇合適的信號(hào)肽可以將其表 達(dá)量成倍提高，無論對于工業(yè)生產(chǎn)還是科學(xué)研究，其意義都是非常深遠(yuǎn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明目的是提供一種可以引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)(如抗體）高效表達(dá)的信號(hào)肽，以降低 外源蛋白的生產(chǎn)成本。
[0014] 首先，本發(fā)明提供了一種人工合成的用于引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌 表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0015] SEQ ID N0:1MGKWVKVLFALICIAVAYS
[0016] 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary, CH0)、 幼年倉鼠腎細(xì)胞（baby hamster kidney，BHK)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0)、小鼠乳腺腫瘤細(xì) 胞（C127)、人胚腎 293 細(xì)胞（human embryonic kidney293, ΗΕΚ293)等。
[0017] 本發(fā)明的信號(hào)肽可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)外源蛋白（如抗體）的分泌表 達(dá)。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述用于引導(dǎo)外源蛋白（如抗 體）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽。
[0019] 進(jìn)一步的，所述多核甘酸的序列為SEQ ID NO:7 :
[0020] ATGGGAAAATGGGTGAAAGTGCTGTTTGCCCTGATCTGTATTGCAGTGGCATATAGC (SEQ IDNO:7)
[0021] 本發(fā)明的多核苷酸可通過常規(guī)的合成方法制備。
[0022] 本發(fā)明的多核苷酸可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，用于引導(dǎo)外源蛋白的分泌 表達(dá)。
[0023] 利用本發(fā)明的信號(hào)肽在動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體）的方法為：將編碼本 發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸與編碼表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體）的多核苷酸連接后克隆入哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)載體，而后將該重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后表達(dá)目的蛋白。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有前述編碼本發(fā)明 信號(hào)肽的多核苷酸及編碼哺乳動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0025] 所述表達(dá)載體中，編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動(dòng)物來源的 蛋白質(zhì)的多核苷酸前端。本發(fā)明引用了天然抗體信號(hào)肽進(jìn)行對比，氨基酸序列為SEQ ID NO:2-6。
[0026] SEQ ID NO:2METPAQLLFLLLLWLP(GenBank:AAA36085. I, Homo sapiens)
[0027] SEQ ID NO:3MGWSCIILFLVATATGVHS(GenBank:CAA25967. I, Mus musculus)
[0028] SEQ ID NO:4MGWSCIILFLVATATG (GenBank:AAA38605. I, Mus musculus)
[0029] SEQ ID NO:5MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (GenBank:CAB46315. I, Mus musculus)
[0030] SEQ ID N0:6MDMRVPAQLLGLLLLWLPG (GenBank:AAA58934. I, Homo sapiens)
[0031] 所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是EF-I a (human elongation factor-1 a )啟動(dòng)子、 hCMV (human cytomegalovirus)啟動(dòng)子、SV40 (Simian vacuolating virus40)晚期啟動(dòng) 子、SV40早期啟動(dòng)子或者EF-I α與hCMV啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子等。
[0032] 如本發(fā)明實(shí)施例列舉的，所述表達(dá)載體為Freedom pCHOl.O。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為前述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選自CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。
[0034] 所述外源蛋白可以為任意蛋白質(zhì)，如抗體、融合蛋白或者非融合蛋白等
[0035] 本發(fā)明將本發(fā)明信號(hào)肽與天然抗體信號(hào)肽進(jìn)行比較，外源蛋白表達(dá)量的測定結(jié)果 表明，本發(fā)明的信號(hào)肽特別適用于CHO細(xì)胞的外源蛋白表達(dá)，與現(xiàn)有信號(hào)肽相比，在動(dòng)物細(xì) 胞中的外源蛋白（如抗體)表達(dá)量獲得大幅提升，表達(dá)水平提高了 2倍以上，其應(yīng)用有利于篩 選到高表達(dá)單克隆細(xì)胞株，并可以降低生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0036] 圖 IFreedom pCHOL 0 表達(dá)載體圖
[0037] 圖2本發(fā)明信號(hào)肽與天然抗體信號(hào)肽引導(dǎo)的外源蛋白表達(dá)量對比圖
[0038] 圖3利用本發(fā)明信號(hào)肽制備的貝伐單抗的純度
[0039] 圖4利用本發(fā)明信號(hào)肽制備的貝伐單抗的輕鏈N端測序圖譜
[0040] 圖5利用本發(fā)明信號(hào)肽制備的貝伐單抗的重鏈N端測序圖譜
[0041] 圖6利用本發(fā)明信號(hào)肽制備的貝伐單抗的完整分子量圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不對其發(fā)明范圍進(jìn)行限制
[0043] 本發(fā)明實(shí)施例所列舉的表達(dá)載體為Freedom pCHO