一種小分子多肽zy4及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感 染抗腫瘤藥物及化妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 痤瘡是一種毛囊性皮脂腺的慢性炎癥，是青少年時(shí)期常見(jiàn)的炎性皮膚病，好發(fā)生 于面頰、額部、頰部和鼻唇溝，其次是胸部、背部和肩部，其發(fā)病主要與性激素水平、皮脂腺 大量分泌、痤瘡丙酸桿菌增殖、毛囊皮脂腺導(dǎo)管的角化異常及炎癥等因素相關(guān)。青春期的皮 膚表面脂質(zhì)成分有所改變，雄性激素增多，造成皮脂毛囊導(dǎo)管角化過(guò)度，毛囊壁上脫落的上 皮細(xì)胞與皮脂混合，栓塞在毛囊口內(nèi)，形成粉刺，再受丙酸菌等作用，加上細(xì)菌感染，引起炎 癥，產(chǎn)生膿瘡，患后異常痛苦。
[0003] 腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì) 其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物。根據(jù)腫瘤對(duì)人體危害的大小 及其生長(zhǎng)特性而分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩類。惡性腫瘤生長(zhǎng)迅速，生長(zhǎng)時(shí)常向周圍組織 浸潤(rùn)，表面幾無(wú)包膜，常有全身轉(zhuǎn)移。目前，惡性腫瘤的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，在各種疾 病的死亡原因中也占前幾位，因而是重點(diǎn)防治的一種疾病。
[0004] 抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在 1000~7000左右，由10~60個(gè)氨基酸殘基組成?？咕氖钱?dāng)生物受到微生物侵入后機(jī) 體迅速產(chǎn)生的高效、光譜的抗菌肽類分子，來(lái)參與機(jī)體的免疫反應(yīng)?？咕淖鳛闄C(jī)體有效 的防御分子是廣泛存在的，目前已從微生物、植物、昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物甚 至人體內(nèi)鑒定出上千種抗菌肽。抗菌肽抗菌機(jī)理復(fù)雜，但大多數(shù)理論都認(rèn)為其機(jī)制涉及到 抗菌肽的陽(yáng)離子性和疏水性與帶負(fù)電荷的微生物胞膜的作用，抗菌肽和細(xì)菌的細(xì)胞膜接觸 后，引起膜通透性改變，或在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，最后導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而 死亡。因此，抗菌肽在殺滅細(xì)菌的速度上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的抗生素，且不像抗生素在低濃 度下抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用幾乎都是致死性的。研宄表明：抗菌肽與傳統(tǒng) 抗生素相比，不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生；抗菌譜光，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)及癌細(xì)胞均有 作用。已經(jīng)在家禽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)家族的抗菌肽，包括cathelicidin，liver-expressed antimicrobial peptide (LEAP)，and β-defensin。這些抗菌肽對(duì)于家禽抵抗細(xì)菌性、病 毒性疾病具有至關(guān)重要的作用，相關(guān)這些基因的突變或者缺失對(duì)于家禽抗微生物感染的 能力將有顯著的影響；這些抗菌肽除了具有光譜抗菌活性，同時(shí)還有高效的抗真菌、抗病 毒、抗原蟲(chóng)和（或）抗腫瘤活性，如Bat5和Mc7能殺滅鉤端螺旋體，對(duì)白色念珠菌、隱球 菌和胞膜病毒和寄生蟲(chóng)都有較好的殺滅作用；一些抗菌肽對(duì)皰瘆病毒、流感病毒、艾滋病 病毒有囊膜病毒有明顯的殺傷力；此外，有些抗菌肽同時(shí)還具有多種其他的調(diào)控功能，如 Cathelicidin還具有促進(jìn)傷口愈合、組織損傷修復(fù)、化學(xué)趨化作用、促血管生成和抗寄生蟲(chóng) 等功能，在調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫上有著重要生物學(xué)活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種小分子多肽ZY4 ;
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感染、抗 腫瘤藥物及化妝品中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：小分子多肽ZY4,它包含17個(gè)氨基酸殘 基，分子量為2374. ODa，等電點(diǎn)為10. 74,其氨基酸序列如SEQ ID: 1所示，為纈氨酸-半胱氨 酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸-色 氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-半胱氨酸-繳氨酰胺（ValCysLysArgTrpLysLysTrpLys ArgLysTrpLysLysTrpCysVal-NH2)，所述基因序列中兩個(gè)半胱氨酸形成一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵， C-末端的Val酰胺化。
[0008] 本發(fā)明的小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感染、抗腫瘤藥物及化妝品中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中的多肽ZY4為人工合成，具有分子量小、人工合成 方便的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的多肽ZY4通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明抑菌效果明顯，對(duì)痤瘡具有顯著的治療效果； 該多肽還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用；小分子多肽ZY4能夠在制備 抗感染、抗腫瘤和治療痤瘡藥物及化妝品中應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為小分子多肽ZY4對(duì)小鼠耳痤瘡模型的治療作用示意圖。
[0011] 圖2為小分子多肽ZY4對(duì)小鼠耳痤瘡模型炎癥的治療作用示意圖。
[0012] 圖3為小分子多肽ZY4抗肺癌細(xì)胞A549活性的示意圖。
[0013] 圖4為小分子多肽ZY4抗乳腺癌細(xì)胞MDA-435活性的示意圖。
[0014] 圖5為小分子多肽ZY4抗黑色素瘤細(xì)胞A357活性的示意圖。
[0015] 圖6為小分子多肽ZY4抗肝癌細(xì)胞HepG2活性的示意圖。
[0016] 圖7為小分子多肽ZY4抗胃癌細(xì)胞SGC7901活性的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以 下所述：
[0018] 實(shí)施例1 :小分子多肽ZY4的制備
[0019] 1.稱取樹(shù)脂0.2g放置于干燥潔凈的反應(yīng)管中，加入適量的N，N-二甲基酰胺 (DMF)，活化30min。稱取第一氨基酸殘基lmmol，4-二甲氨基吡啶（DMAP) 150mg加入到反應(yīng) 管中，DMF做為溶劑反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后用DMF洗3-6次，加入適當(dāng)?shù)倪拎ず鸵宜狒w積比 為1: 1，反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后DMF洗3-6次。然后用哌啶洗脫氨基酸的保護(hù)基團(tuán)Fmoc，洗 脫兩次，每次15min，再用DMF洗4次，甲醇洗2次；
[0020] 2.稱第二個(gè)氨基酸3mmol，HBTU 3_〇1于反應(yīng)管中，加入DIEA 0· 5ml，反應(yīng)40min， 用DMF洗3-6次，加入哌啶溶液兩次洗脫氨基酸的保護(hù)基團(tuán)Fmoc，每次lOmin，再用DMF洗 4次，甲醇洗2次；
[0021] 3.重復(fù)第二個(gè)步驟直到最后一個(gè)氨基酸殘基；
[0022] 4.最后一個(gè)氨基酸反應(yīng)完畢后，用三氟乙酸切割2h，反應(yīng)抽濾，得到多肽的三氟 乙酸溶液，用乙醚沉淀，離心，再用乙醚洗3-5遍，得到白色固體，經(jīng)過(guò)HPLC脫鹽凍干得到多 肽樣本。
[0023] 實(shí)施例2 :小分子多肽ZY4抗菌實(shí)驗(yàn)
[0024] 1.分別制備大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶血性葡萄 球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液，37°C恒溫培養(yǎng)18h，備用；
[0025] 2.配制濃度為0· 8~20 μ g/ml小分子多肽ZY4溶液，將直徑為5~7mm的圓形定 性濾片消毒烘干后浸入上述不同濃度的小分子多肽ZY4溶液中；
[0026] 3.制備高柱肉湯瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，備用；
[0027] 4.溶化高柱肉湯瓊脂培養(yǎng)基，冷卻至50°C，分別加入大腸桿菌、白色念珠菌、金黃 色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液lml，輕搖 均勻，倒入無(wú)菌平皿，輕晃使培養(yǎng)基均勻平鋪在平皿上；
[0028] 5.用消毒過(guò)的鑷子將濾片整齊、有序的放入冷卻的平皿內(nèi)，蓋上陶瓦蓋，并做標(biāo) 記，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h ;
[0029] 6.用卡尺測(cè)量抑菌圈大小，并比較不同濃度小分子多肽ZY4對(duì)不同細(xì)菌的作用強(qiáng) 度，結(jié)果如表1、表2。
[0030] 表 1 :
[0031]
[0032] 如表1所不：小分子多肽ZY4對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽 孢桿菌的最低抑菌濃度分別為 12. 15 μ g/ml、2. 12 μ g/ml、2. 14 μ g/ml、l. 10 μ g/ml。
[0033] 表 2 :
[0034]
[0035] 如表2所示：小分子多肽ZY4對(duì)痤瘡有關(guān)的金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表 皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為2. 25 μ g/ml、2. 17 μ g/ml、2. 45 μ g/ml、 I. 10 μ g/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小分子多肽ZY4具有顯著的抑菌作用。
[0036] 實(shí)施例3 :小分子多肽ZY4對(duì)小鼠耳痤瘡模型的治療作用
[0037] 1.用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)痤瘡丙酸桿菌ATCC11817,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，生理鹽水洗 滌2次，生理鹽水重懸至5 X 108CFU/ml ;
[0038] 2.選取重量為18g的雄性小鼠，昆明種，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為治療組、 陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每只腹腔注射120 μ 1、1 %的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，然后在小鼠左 耳皮內(nèi)注射重懸后的菌液20 μ 1/只；
[0039] 3.用聚乙二醇、甘油將小分子多肽ΖΥ4、克林霉素分別配制成2mg/ml軟膏，其中聚 乙二醇與甘油的重量份比為5:1，涂擦小鼠左耳皮膚表面，治療組涂擦小分子多肽ZY4,陽(yáng) 性對(duì)照組涂擦克林霉素，陰性對(duì)照組涂擦聚乙二醇，每8h -次，共給藥3次，24h后處死小 鼠；
[0040] 4.用干凈的酒精棉球消毒小鼠左耳，剪下左耳并剪碎，轉(zhuǎn)移至勻漿器中充分勻漿， 1只耳朵加入1ml生理鹽水勻漿；
[0041] 5.稀釋勻漿液至1000倍，取50 μ 1稀釋液涂腦心浸液培養(yǎng)基平板，37°C厭氧培養(yǎng) 72h，計(jì)數(shù)菌落。結(jié)果如圖1所示：給予2mg/ml的小分子多肽ZY4治療后痤瘡丙酸桿菌的菌 落數(shù)為2. IX 105,給予2mg/ml克林霉素治療后痤瘡丙酸桿菌的菌落數(shù)為5. 6 X 105,給予聚 乙二醇治療后痤瘡丙酸桿菌的菌落數(shù)為9. 44X 105,表明：ZY4對(duì)小鼠耳痤瘡治療效果明顯 好于克林霉素。
[0042] 實(shí)施例4 :小分子多肽ZY4對(duì)小鼠耳痤瘡模