分別為45. 52g、42. 36g、31. 76g，收率分別為90. 93%、 91. 02%、91. 46%。
[0029] 實(shí)施例11:齊考諾肽線性肽肽樹脂的制備 將實(shí)施例5中6mmol的[19-25]肽樹脂A放入合成管中，加入180ml的DCM溶脹 30min ;抽濾掉DCM，用180ml的DMF洗3次；加入20%哌啶/DMF溶液120ml脫保護(hù)2次， 分別反應(yīng)10min和15min ;然后用120ml DMF、DCM、DMF分別洗滌2次；加入中間體片段B 30. 04g(18mmol)、HOAT 2. 68g(19. 8mmol)和 DIC 3. 07ml (19. 8mmol)的 DMF 溶液 80ml，鼓 隊(duì)攪拌反應(yīng)3_4h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測結(jié)果為準(zhǔn)，反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后，抽掉反應(yīng)液，用 180ml DMF、DCM、DMF分別洗滌2次；隨后再脫保護(hù)。如此反復(fù)循環(huán)操作，依次連接中間體片 段C和D，脫去最后一個氨基酸的Fmoc保護(hù)基，用180ml DCM和甲醇分別洗滌3次，真空干 燥得肽樹脂48. 56g。
[0030] 實(shí)施例12:齊考諾肽線性肽肽樹脂的制備 將實(shí)施例6中3mmol的[19-25]肽樹脂A放入合成管中，加入120ml的DCM溶脹 30min ;抽濾掉DCM，用120ml的DMF洗3次；加入20%哌啶/DMF溶液120ml脫保護(hù)2次， 分別反應(yīng)10min和15min ;然后用120ml DMF、DCM、DMF分別洗滌2次；加入中間體片段B 11. 45g(9mmol)、HOATL 34g(9. Qmmol)和 DIC I. 53ml (9. Qmmol)的 DMF 溶液 50ml，鼓隊(duì)攬 拌反應(yīng)3-4h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測結(jié)果為準(zhǔn)，反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后，抽掉反應(yīng)液，用120ml DMF、DCM、DMF分別洗滌2次；隨后再脫保護(hù)。如此反復(fù)循環(huán)操作，依次連接中間體片段C和 D，脫去最后一個氨基酸的Fmoc保護(hù)基，用120ml DCM和甲醇分別洗滌3次，真空干燥得肽 樹脂 30. 46g。
[0031] 實(shí)施例13:齊考諾肽線性肽的制備 稱取實(shí)施例11所得齊考諾肽肽樹脂48. 56g置于1000 ml圓底燒瓶中，冰浴下加入 500ml裂解試劑（三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82. 5/5/5/5/2. 5,體積比）， N2保護(hù)攪拌反應(yīng)4h后，抽濾除去樹脂，將濾液緩慢傾倒入-20°C預(yù)冷的5L甲基叔丁基醚中， 冰柜內(nèi)靜置lh，離心得到的固體，用甲基叔丁基醚洗滌6次后真空干燥得粗肽17. 78g，純度 81. 23%，收率 112. 03%。
[0032] 實(shí)施例14:齊考諾肽線性肽的制備 稱取實(shí)施例12所得齊考諾肽肽樹脂30. 46g置于1000 ml圓底燒瓶中，冰浴下加入 330ml裂解試劑（三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82. 5/5/5/5/2. 5,體積比）， N2保護(hù)攪拌反應(yīng)4h后，抽濾除去樹脂，將濾液緩慢傾倒入-20°C預(yù)冷的3. 5L甲基叔丁基醚 中，冰柜內(nèi)靜置lh，離心得到的固體，用甲基叔丁基醚洗滌6次后真空干燥得粗肽8. 65g，純 度 81. 23%，收率 108. 94%。
[0033] 實(shí)施例15:齊考諾肽的制備 配制0. 5mol/LM和lmmol/L的乙酸銨和EDTA的緩沖溶液，加入實(shí)施例13中的5. OOg 齊考諾肽線性肽（濃度為2mg/ml)，再加入GSH(還原型谷胱甘肽）和GSSG(氧化型谷胱 甘肽），使其濃度分別為〇. 5mmol/L和0. lmmol/L，用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)PH值至7. 8,放于 2~8°C低溫靜置反應(yīng)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)純化、凍干得到齊考諾肽精肽 3. 06g，純度 99. 62%，收率 61. 20%。
[0034] 實(shí)施例16:齊考諾肽的制備 配制0. 6mol/L和I. 5mmol/L的乙酸銨和EDTA的緩沖溶液，加入實(shí)施例14中的5. OOg 齊考諾肽線性肽（濃度為lmg/ml)，再加入半胱氨酸和胱氨酸使其濃度分別為1.0 mmol/L和 0. lmmol/L，用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)PH值至8. 2,放于2~8°C低溫靜置反應(yīng)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)終 點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)純化、凍干得到齊考諾肽精肽3. 22g，純度99. 70%，收率64. 40%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 以氨基樹脂為固相載體，再按序列依次偶聯(lián)7個Fmoc保護(hù)氨基酸，得側(cè)鏈保護(hù)的齊 考諾肽片段A [19-25]肽樹脂； 齊考諾肽片段A [19-25]肽樹脂為： H-Ser (tBu) -Cys (Trt) -Arg (pbf) -Ser (tBu) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt)-氨基樹脂； (2) 以CTC樹脂為固相載體，按照以下序列從C端向N端依次進(jìn)行縮合反應(yīng)得到側(cè)鏈全 保護(hù)的齊考諾肽片段B[12-18]肽樹脂、片段C[6-ll]肽樹脂和片段D[5-l]肽樹脂； 齊考諾肽片段B [12-18]肽樹脂為： Fmoc-Met-Tyr (tBu) -Asp (OtBu) -Cys (Trt) -Cys (Trt) -Thr (tBu) -Gly-CTC 樹脂； 齊考諾肽片段C [6-11]肽樹脂為： Fmoc-Ala-Lys (Boc) -Cys (Trt) -Ser (tBu) -Arg (pbf) -Leu-CTC 樹脂； 齊考諾肽片段D [1-5]肽樹脂為： Fmoc- Cys (Trt)-Lys (Boc)-Gly-Lys (Boc)-Gly-CTC 樹脂； (3) 將片段B、C、D的肽樹脂進(jìn)行裂解，得到全保護(hù)肽片段B、C、D，其結(jié)構(gòu)為： 齊考諾肽片段B [12-18]為： Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp (OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-OH ； 齊考諾肽片段C [6-11]為： Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-OH ； 齊考諾肽片段D [1-5]為： Fmoc- Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-OH ； (4) 齊考諾肽片段A [19-25]肽樹脂與全保護(hù)肽片段B在縮合劑存在下發(fā)生接肽反 應(yīng)，生成14個氨基酸的肽樹脂，再按照同樣的操作依次連接全保護(hù)肽片段C和D，最后脫除 Fmoc，完成齊考諾肽線性肽樹脂的制備；齊考諾肽線性肽樹脂的結(jié)構(gòu)如下：(5) 肽樹脂經(jīng)裂解試劑裂解得到齊考諾肽的線性肽粗品； (6) 將齊考諾肽的線性肽用乙酸銨和EDTA的緩沖水溶液溶解后，加入輔助氧化劑，調(diào) 節(jié)溶液pH值至7. 5~8. 5, 2~8°C下低溫靜置反應(yīng)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，得到含二硫鍵的齊考 諾肽粗品； (7) 將齊考諾肽粗品溶液pH值調(diào)至3-6后經(jīng)制備色譜純化，凍干得到齊考諾肽精肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，步驟（1)所述氨 基樹脂為Rink Amide樹脂或Rink Amide-AM樹脂，替代度為0. 2~0. 5mmol/g。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于：步驟⑵中所 述的CTC樹脂的替代度為0. 6~1. 2mmol/g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于：步驟⑶中全 保護(hù)肽樹脂裂解試劑組合為TFE/DCM、TFA/DCM、AcOH/TFE/DCM、HFIP/DCM中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，步驟（4)中的縮 合劑為：DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/ HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA 中 的一種；脫Fmoc試劑為體積含量為15~25%的哌啶/DMF溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，步驟（5)中所述 的線性肽的裂解試劑為體積含量為1-20%清除劑的TFA溶液，所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫 醚、乙二硫醇、巰基乙醇、苯酚、水和三異丙基硅烷中的一種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，步驟（6)中控制 線性肽的濃度為0. 5~2mg/ml，乙酸銨的濃度為0. 5~0. 7mol/L ;EDTA的濃度為0. 5-1. 5mmol/ L08. 根據(jù)權(quán)利要求1所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，步驟（6)中輔助 氧化劑組合為GSH (還原型谷胱甘肽）/GSSG (氧化型谷胱甘肽）、半胱氨酸/胱氨酸中的一 種。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，氧化劑組合 GSH(還原型谷胱甘肽）/GSSG (氧化型谷胱甘肽）中GSH(還原型谷胱甘肽）的加入濃度為 0. l-10mmol/L，GSSG (氧化型谷胱甘肽）的加入濃度為0. 05-lmmol/L。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述片段法固相合成齊考諾肽的方法，其特征在于，氧化 劑組合半胱氨酸/胱氨酸中半胱氨酸的加入濃度為0. l-10mm〇l/L，胱氨酸的加入濃度為 0.05-lmmol/L〇
【專利摘要】本發(fā)明屬于多肽合成領(lǐng)域，涉及一種片段法固相合成齊考諾肽的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有制備方法存在的合成周期長、粗肽純度低、3對二硫鍵形成過程操作繁雜、總收率低等技術(shù)難題。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：首先采用固相法合成齊考諾肽的4個片段肽[19-25]A、[12-18]B、[6-11]C、[1-5]D；再按照順序依次將全保護(hù)肽片段B、C、D連接到肽樹脂A上，裂解得到齊考諾肽線性肽；最后通過條件溫和，操作精簡，后處理容易，環(huán)保的液相一步氧化得到齊考諾肽。此技術(shù)方案可以大大縮短合成周期，降低合成、純化難度和生產(chǎn)成本，提高線性肽純度和產(chǎn)物的總收率；利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K14/435, C07K1/04, C07K1/06
【公開號】CN104974237
【申請?zhí)枴緾N201510421787
【發(fā)明人】張穎, 楊慧, 李同金, 石鑫磊, 王仁友
【申請人】濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年7月18日