一種Aβ1-42寡聚體及其制備、鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及β-淀粉樣蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種Αβ 1-42寡聚體及其制備、鑒定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' S disease，AD)也稱為老年癡呆癥，是發(fā)生在老年期 或老年前期的一種慢性、持續(xù)性、退化性的腦變性疾病，其臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙、 人格改變等。該病的病理特征主要包括大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域的細(xì)胞外出現(xiàn)以淀粉樣蛋 白（beta-amyloid, Αβ)為核心的老年斑、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)等病變。在美國(guó)AD是僅 次于心血管病、癌癥和腦卒中的第四大死亡殺手，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全世界AD發(fā)病人數(shù)高達(dá)2500 萬，我國(guó)AD患者已達(dá)到600余萬，居世界首位，AD病程時(shí)間長(zhǎng)且目前尚無徹底根治的藥物， 它嚴(yán)重威脅著人類的健康，給患者及家屬帶來巨大的影響。因此建立理想及可靠的AD動(dòng)物 模型，對(duì)于研宄和探討AD的病因、病理過程以及尋找和篩選有效藥物顯得尤為重要。
[0003] Αβ是由淀粉樣前體蛋白經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的含有39~ 43個(gè)氨基酸的多肽，A β的大量沉積，是導(dǎo)致AD病人腦內(nèi)老年斑周邊神經(jīng)元變性和死亡的 主要原因。Αβ在腦內(nèi)有多種存在形式，如：低分子量Αβ單體、Αβ寡聚體、不溶性Αβ纖 維體等。Αβ單體是可溶性的低分子物質(zhì)，但是當(dāng)胞內(nèi)環(huán)境，如pH、溫度、離子濃度、蛋白濃 度等改變時(shí)會(huì)誘發(fā)Αβ單體快速聚集，形成二聚體、三聚體或可溶性的Αβ寡聚體，Αβ寡 聚體的穩(wěn)定性較差，易向Αβ纖維體轉(zhuǎn)化。Αβ的種類分為Αβ 1-39、Αβ 1-40、Αβ 1-41、 Αβ 1-42和Αβ 1-43,其中Αβ 1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研宄Αβ 1-42 是當(dāng)前的熱點(diǎn)。
[0004] 近年來，有科學(xué)家提出，Aβ纖維體與記憶損害及神經(jīng)細(xì)胞缺乏的關(guān)系不大，推測(cè) 可溶性A β單體和A β寡聚體是AD的主要致病因素。國(guó)內(nèi)外制備、合成A β 1-42的寡聚體 均不穩(wěn)定，淀粉樣肽在體外容易隨機(jī)形成各種高分子量或低分子量的混合產(chǎn)物，這種組分 不均一的混合物直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。近年來，許多研宄者用多種方法 制備A β 1-42寡聚體，但收率都較低、產(chǎn)物不穩(wěn)定、成分復(fù)雜。A β 1-42寡聚體的產(chǎn)物不穩(wěn) 定，成分復(fù)雜，就無法保障其誘導(dǎo)模型的成功建立，從而直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可 靠性。因此，制備成分較單一、穩(wěn)定的A β 1-42寡聚體，可為AD動(dòng)物模型的成功建立打下良 好的基礎(chǔ)，也為AD的發(fā)病機(jī)制、病理過程、尋找和篩選有效藥物提供有效依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有制備、合成Αβ 1-42的寡聚體不穩(wěn)定、成分復(fù)雜、收率低等不足，本發(fā)明 提供一種新合成的A β 1-42寡聚體。本發(fā)明提供的A β 1-42寡聚體成分較單一、產(chǎn)物穩(wěn)定， 為建立理想和可靠的AD模型提供良好的基礎(chǔ)；其制備方法簡(jiǎn)單、收率高、省時(shí)；所采用的 SDS-PAGE結(jié)合蛋白免疫印記鑒定方法，具有敏度高、特異性強(qiáng)、方便快速、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較 低等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種A β 1-42寡聚體，所述的A β 1-42寡聚體主要為寡聚體和單體的混合物；所述 寡聚體經(jīng)蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為12-20KD，為三聚體和四聚體；所述單體經(jīng)蛋 白免疫印記法電泳鑒定：分子量為4-4. 5KD。
[0008] 以上所述A β 1-42寡聚體，所述的A β 1-42寡聚體的制備方法為：取A β 1-42合成 肽，在室溫下完全溶解在HFIP中，所得溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，用干浴氮吹儀使HFIP徹底吹 干；加入DMSO使離心管底部的固體完全溶解，加入HEPES緩沖液，混合均勻，即得。
[0009] 以上所述Aβ 1-42寡聚體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1.將Img的Αβ 1-42合成肽，加入220-225 μ L HFIP中，在室溫下靜置30-60分 鐘，得到完全溶解的溶液；
[0011] 2.將步驟1得到的溶液轉(zhuǎn)移到硅化的離心管，在干浴氮吹儀上吹8-15分鐘，使 HFIP徹底吹干，得到透明片狀固體沉于管底；
[0012] 3.在所述離心管中加入40 μ I DMSO,使離心管底部的固體完全溶解，再加入pH值 為7. 4的濃度為IOmM HEPES緩沖溶液，使溶液最后終體積為lml，混合均勾，即得。
[0013] 以上所述A β 1-42寡聚體的鑒定方法，包括以下步驟：
[0014] I. SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳：取A β 1-42寡聚體溶液2 μ L，與18 yL 4Χ電泳上樣 緩沖液混合均勻，然后上樣，電泳上樣量為5ul/泳道，電泳用的膠為4 - 12 %的梯度膠，同 時(shí)在一個(gè)泳道加入10 μ L分子量為3. 6-260KD的預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)品，電泳時(shí)選擇80V電壓 電泳30-40分鐘，然后轉(zhuǎn)IOOv電壓繼續(xù)電泳2小時(shí)；
[0015] 2.轉(zhuǎn)膜：將電泳好的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，半干法轉(zhuǎn)膜，時(shí)間為6分鐘，將 轉(zhuǎn)好的PVDF膜按加樣泳道的大小裁剪，然后將剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分 鐘；
[0016] 3.封閉：再將PVDF膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，搖床上振蕩，搖床 上慢速振蕩，轉(zhuǎn)速可為65-75轉(zhuǎn)/分鐘，室溫條件下封閉1小時(shí)；
[0017] 4.洗膜：將步驟3得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗2-3次， 每次5分鐘；
[0018] 5. -抗孵育：將步驟4得到的PVDF膜浸泡在含有6Ε10的一抗溶液中，室溫下孵 育1小時(shí)；
[0019] 6.洗一抗膜：將經(jīng)過一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6 次，每次5分鐘；
[0020] 7.二抗孵育：將漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中， 室溫下孵育1小時(shí)；
[0021 ] 8.洗二抗膜：將經(jīng)過二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6 次，每次5分鐘；
[0022] 9.化學(xué)發(fā)光曝光：將HRP底物液均勻加在經(jīng)步驟8漂洗過的PVDF膜上，在5-30秒 內(nèi)分別進(jìn)行暗室曝光顯影，從中選擇條帶清晰的膠片作為最后結(jié)果。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：
[0024] 1.本發(fā)明提供的Αβ 1-42寡聚體成分較單一，主要含有12-20KD寡聚體，純度 80%以上，另含有少量4-4. 5KD單體；A β 1-42寡聚體很穩(wěn)定，在4°C至室溫條件下，其分子 量在72小時(shí)內(nèi)基本不變。本發(fā)明為建立理想和可靠的AD模型提供良好的基礎(chǔ)，能保證實(shí) 驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為探討AD的發(fā)病機(jī)制、病理過程以及尋找和篩選有效藥物提供 了有效依據(jù)。
[0025] 2.本發(fā)明Αβ 1-42寡聚體的制備方法簡(jiǎn)單、收率高、省時(shí)、成本低；選用HEPES緩 沖溶液，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍，與F12緩沖液相比取得更好的緩沖效果。
[0026] 3.采用SDS-PAGE結(jié)合蛋白免疫印記法鑒定本發(fā)明Αβ 1-42寡聚體，該方法不僅 能檢測(cè)A β 42單體或寡聚體分子量的大小，同時(shí)還可以檢驗(yàn)A β 42單體或寡聚體的純度，與 酶聯(lián)免疫吸附法、流式熒光技術(shù)、透射電子顯微鏡觀察相比，具有敏度高、特異性強(qiáng)、方便快 速、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低、圖像清晰、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，克服了當(dāng)前蛋白免疫印記法存在的蛋 白質(zhì)變性、背景過高、電泳過程中出現(xiàn)"拖尾"現(xiàn)象、陽性條帶很弱等問題。
[0027] 4.本發(fā)明整個(gè)檢測(cè)過程均在室溫下進(jìn)行，減少加熱、冷卻等步驟，簡(jiǎn)化了整個(gè)操作 過程；一抗與二抗都是來源于鼠其匹配性極好、濃度適宜、不會(huì)與封閉劑有交叉反應(yīng)、二抗 不會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合、一抗中含有6Ε10,檢測(cè)過程中不會(huì)出現(xiàn)背景高、陽性條帶很弱等現(xiàn) 象。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例1、2得到的Αβ 1-42寡聚體的蛋白免疫印跡圖。
[0029] 圖2為實(shí)施例1得到的Αβ 1-42寡聚體合成后隨時(shí)間變化規(guī)律圖。
[0030] 圖3為實(shí)施例1得到的Αβ 1-42寡聚體造模手術(shù)前后穩(wěn)定性試驗(yàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍和應(yīng)用 范圍。
[0032] -、儀器和試劑
[0033] L主要儀器。
[0034] (1)干浴氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司提供
[0035] (2)振蕩儀 德國(guó)eppendorf公司提供
[0036] (3)電泳槽 美國(guó)invitrogen公司提供
[0037] (4)轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)invitrogen公司提供
[0038] (5)PVDF 膜 美國(guó) Life technologies 公司提供，貨號(hào)：IB401001
[0039] 2.主要試劑。
[0040] (I)Aβ 1-42 合成肽，英文名：β -Amyloid(1-42)，分子式 C203H311N55O60S1，分 子量4514. 1，Chinese P印tide公司提供，貨號(hào)：AMYD-003,純度96. 9 %以上，序列如 T ：Asp-AIa-GIu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-GIy-Tyr-GIu-Val-His-His-GIn-LyS-Leu-Va I-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val -Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala0
[0041] (2)冊(cè)1?，中文名：1，1，1，3,3,3-六氟-2-丙醇，德國(guó)81 8111&公司提供，貨號(hào)：105228。
[0042] (3)DMS0,中文名：二甲基亞砜，德國(guó)sigma公司提供，貨號(hào)：D8418。
[0043] (4)HEPES，中文名：4-羥乙基哌嗪乙磺酸，德國(guó)sigma公司提供，貨號(hào)：H4034-25G。
[0044] (5) SDS，中文名：十二烷基硫酸鈉。
[0045] (6) SDS-NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris gel 的梯度膠：美國(guó) Life technologies 公司提供，貨號(hào)：NP0335B0X。
[0046] (7)分子量為3. 6-260KD的預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)invitrogen公司提供，商品 名為：Novex? Sharp Pre-stained Protein Standard，貨號(hào) LC5800。
[0047] (8) Tween_2〇: scientific research special 公司提供，貨號(hào)：〇777〇
[0048] (9)Tris :Solarbio 公司提供，貨號(hào)：T8060〇
[0049] (10)脫脂奶粉：scientific research special 提供，貨號(hào)：232100〇
[0050] (11) -抗（淀粉樣蛋白抗體）：美國(guó)Convance公司提供，商品名為： β-Amyloid, 1-16 (6E10)mAb，貨號(hào)：SIG-39300。
[0051] (12)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 提供，商品名：a Mo IgG(H+L)/HRP，貨號(hào)：ZB-2305。
[0052] (13)HRP 底物液：美國(guó) miIlipore 公司提供，商品名：ImmobiIon tm western/ chemiluminescon HRP substrate，貨號(hào)：WBKLSOlOOo
[0053] 3.溶液的配制。
[0054] (I) pH值為7. 4的濃度為IOmM HEPES緩沖溶液：取0· 0238g的HEPES溶解于IOml