改性聚乙烯亞胺及其在制備基因轉(zhuǎn)染載體試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及聚合物改性領(lǐng)域，具體涉及一種改性聚乙烯亞胺及其在制備基因轉(zhuǎn)染 載體試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將具備一定功能的外源核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，并在細(xì)胞中表 達(dá)，以獲得預(yù)期目的，因此作為一種關(guān)鍵技術(shù)被廣泛地應(yīng)用基因治療，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，生物 制藥工程等領(lǐng)域。將外源的基因?qū)肷锛?xì)胞內(nèi)需要借助基因轉(zhuǎn)染載體，目前常用的載體 分為病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi)。盡管病毒載體轉(zhuǎn)染率尚，但其對(duì)外源基因的容納量少 (約為4. 5~30kbp)、穩(wěn)定性差，且病毒DNA在人體內(nèi)有復(fù)制的可能，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫 反應(yīng)，存在致病致癌的風(fēng)險(xiǎn)，具有潛在的健康安全問(wèn)題。非病毒載體包括陽(yáng)離子聚合物和脂 質(zhì)體等，脂質(zhì)體雖然有較高的生物兼容性的優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)在于其在體內(nèi)不夠穩(wěn)定。
[0003] 目前研宄得較多的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是陽(yáng)離子聚合物，主要有聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI)、聚酰胺一酰亞胺（PAMAM)、殼聚糖、聚賴(lài)氨酸等。這些聚合物能與 基因有效地形成共價(jià)鍵，并對(duì)基因有一定的保護(hù)作用，從而避免外源基因被核酸酶降解。
[0004] 聚乙烯亞胺是一種水溶性高分子聚合物，其表面具有大量的正電荷，能夠攜帶基 因穿透靶細(xì)胞的細(xì)胞膜，達(dá)到基因轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶細(xì)胞作用，具有穩(wěn)定性高，成本低，轉(zhuǎn)染率高的 優(yōu)點(diǎn)，因此成為基因轉(zhuǎn)染研宄中最廣泛應(yīng)用的非病毒載體材料之一。然而聚乙烯亞胺對(duì)細(xì) 胞的毒性較大，特別是高分子量聚乙烯亞胺，雖然具有很強(qiáng)的穿透細(xì)胞膜能力和很高基因 轉(zhuǎn)染效率，但毒性更大，嚴(yán)重影響其在生物，醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0005] 松香酸是一種天然的樹(shù)脂酸，來(lái)源廣泛，作為一種重要的工業(yè)原料，其具有生物相 容性高，成本低廉和一定的疏水性等特點(diǎn)。因此其應(yīng)用范圍極廣，在表面活性劑，醫(yī)藥等均 有使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種改性聚乙烯亞 胺，該改性聚乙烯亞胺為一種松下酸（包括松香酸和脫氫松香酸）接枝聚乙烯亞胺的陽(yáng)離 子聚合物，作為非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，能有效降低聚乙烯亞胺的細(xì)胞毒性，具有很高的生物 兼容性和基因轉(zhuǎn)染能力，并且能形成穩(wěn)定性高的納米膠束。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述改性聚乙烯亞胺的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述改性聚乙烯亞胺在制備基因轉(zhuǎn)染載體試劑中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一種改性聚乙烯亞胺，其結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0011]
[0012] 其中，所述的取代基R為
[0013] X、y分別代表重復(fù)單元數(shù)目，X為0~50000 ;y為0~50000 ;
[0014] 所述的改性聚乙烯亞胺主鏈聚乙烯亞胺的分子量?jī)?yōu)選為6000~40000 ;取代基R 的取代度優(yōu)選為〇. 5%~20% ;
[0015] 所述的改性聚乙烯亞胺的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)將活化劑和松香酸或脫氫松香酸混合充分溶解于有機(jī)溶劑，在0~25°C反應(yīng) 6 ~24h ;
[0017] (2)將聚乙烯亞胺充分溶解于有機(jī)溶劑后，將步驟（1)所制備的溶液滴入聚乙烯 亞胺溶液中，加入縮合劑和N，N-二異丙基乙基胺，并通氮?dú)獗Ｗo(hù)，在0~25 °C反應(yīng)8~24h ; 反應(yīng)完畢后，干燥，透析再干燥，得到改性聚乙烯亞胺；
[0018] 步驟（1)所述的活化劑優(yōu)選為N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基硫代琥珀酰亞胺；
[0019] 步驟⑴所述的活化劑和松香酸或脫氫松香酸的摩爾比為（1. 2 :1)~（2 :1);
[0020] 步驟⑴所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為四氫呋喃、甲醇和異丙醇中的至少一種；
[0021] 步驟（2)所述的聚乙烯亞胺分子量為6000~40000 ;
[0022] 步驟（2)所述的縮合劑優(yōu)選為O-苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸；
[0023] 步驟（2)所述的聚乙烯亞胺與松香酸或脫氫松香酸的摩爾比為（1 :0. 01)~（1 : 0.5)；
[0024] 步驟（2)所述的聚乙烯亞胺與N，N-二異丙基乙基胺的摩爾比為（1 :0. 01)~（1 : 0.5)；
[0025] 步驟⑵所述的聚乙烯亞胺與縮合劑的摩爾比為（1 :0. 01)~（1 :0. 3);
[0026] 步驟⑵所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為四氫呋喃、甲醇和異丙醇中的至少一種；
[0027] 上述方法制備得到的改性聚乙烯亞胺能夠溶解于水，在水中形成穩(wěn)定的納米膠束 (粒徑為20~400nm)，能夠負(fù)載基因，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明對(duì)比聚乙烯亞胺，其保持具有較高的基 因轉(zhuǎn)染能力，同時(shí)，對(duì)細(xì)胞的毒性顯著降低，具有較高的生物安全性，可以應(yīng)用于制備基因 轉(zhuǎn)染載體，具有生物安全性高，轉(zhuǎn)染效率高，成本低廉的特點(diǎn)。
[0028] 所述的改性聚乙烯亞胺在制備基因轉(zhuǎn)染載體試劑中的應(yīng)用；
[0029] 本發(fā)明的原理是：由于聚乙烯亞胺具有親水性，本發(fā)明將具有疏水性的松香酸或 脫氫松香酸接枝到聚乙烯亞胺上，該改性聚乙烯亞胺能的疏水基團(tuán)在水中由于分子間作用 力形成具有強(qiáng)大疏水性的致密的疏水核，親水的聚乙烯亞胺則形成親水外殼，從而形成具 有殼核結(jié)構(gòu)的納米膠束，和DNA結(jié)合后形成粒徑很小的納米粒。復(fù)合納米粒子粒徑變小后， 結(jié)構(gòu)就會(huì)更加緊密，這樣更容易穿過(guò)磷脂雙分子層的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而能夠提高轉(zhuǎn)染效率。 聚乙烯亞胺改性的另一個(gè)目的是通過(guò)接枝側(cè)鏈中和一部分正電荷，并形成膠束，降低暴露 在水中的表面積，從而減小聚乙烯的陽(yáng)離子毒性。
[0030] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0031] (1)本發(fā)明制備的疏水基團(tuán)接枝聚乙烯亞胺具有尺寸小的特點(diǎn)，可通過(guò)調(diào)節(jié)長(zhǎng)松 香酸或脫氫松香酸的投料比來(lái)獲得不同的疏水鏈接枝率從而調(diào)節(jié)疏水基團(tuán)接枝羧甲基殼 聚糖的粒徑大小。疏水基團(tuán)接枝聚乙烯亞胺能夠在水中形成穩(wěn)定的膠束，增強(qiáng)其穩(wěn)定性， 從而降低聚乙烯亞胺的細(xì)胞毒性，并且提高其基因轉(zhuǎn)染能力，另外，其疏水內(nèi)核具有載藥潛 力：具有負(fù)載疏水性藥物分子并緊密的包裹的潛力。
[0032] (2)本發(fā)明的改性聚乙烯亞胺的主要原料之一為松香酸或脫氫松香酸，其來(lái)源豐 富，成本低廉，為化工制藥等工業(yè)廣泛應(yīng)用的原料之一。
[0033] (3)本發(fā)明的改性聚乙烯亞胺由于部分氨基被取代，能形成納米膠束，從而降低細(xì) 胞毒性，并且提高了基因的轉(zhuǎn)染能力。
[0034] (4)本發(fā)明的改性聚乙烯亞胺可作為一種安全高效的基因轉(zhuǎn)染載體，也可以負(fù)載 藥物，因此在基因治療，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)（包括利用RNAi調(diào)控害蟲(chóng)免疫），生物制藥工程和發(fā) 酵工程等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用的價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1是聚乙烯亞胺（分子量10000)轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果分析圖，其中，1~8代 表不同的DNA/聚乙烯亞胺質(zhì)量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0036] 圖2是改性聚乙烯亞胺樣品1轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果分析圖，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亞胺質(zhì)量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0037] 圖3是改性聚乙烯亞胺樣品2轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果分析圖，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亞胺質(zhì)量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0038] 圖4是改性聚乙烯亞胺樣品3轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果分析圖，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亞胺質(zhì)量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0039] 圖5是聚乙烯亞胺（分子量10000)/DNA的復(fù)合物凝膠電泳圖，其中，泳道1為DNA/ 材料質(zhì)量比為I :5 ;泳道2為DNA/材料質(zhì)量比為I :4 ;泳道3為DNA/材料質(zhì)量比為I :3 ;泳 道4為DNA/材料質(zhì)量比為1 :2 ;泳道5為DNA/材料質(zhì)量比為1 :1 ;泳道6為DNA/材料質(zhì) 量比為2 :1 ;泳道7為DNA/材料質(zhì)量比為3 :1 ;泳道8為質(zhì)粒DNA ;泳道9為DNA marker。
[0040] 圖6是改性聚乙烯亞胺樣品2/DNA的復(fù)合物凝膠電泳圖，其中，泳道1為DNA/材 料質(zhì)量比為1 :5 ;泳道2為DNA/材料質(zhì)量比為1 :4 ;泳道3為DNA/材料質(zhì)量比為1 :3 ;泳 道4為DNA/材料質(zhì)量比為1 :2 ;泳道5為DNA/材料質(zhì)量比為1 :1 ;泳道6為DNA/材料質(zhì) 量比為2 :1 ;泳道7為DNA/材料質(zhì)量比為3 :1 ;泳道8為質(zhì)粒DNA ;泳道9為DNA marker。
[0041] 圖7是改性聚乙烯亞胺樣品3/DNA的復(fù)合物凝膠電泳圖，其中，泳道1為DNA/材 料質(zhì)量比為1 :5 ;泳道2為DNA/材料質(zhì)量比為1 :4 ;泳道3為DNA/材料質(zhì)量比為1 :3 ;泳 道4為DNA/材料質(zhì)量比為1 :2 ;泳道5為DNA/材料質(zhì)量比為1 :1 ;泳道6為DNA/材料質(zhì) 量比為2 :1 ;泳道7為DNA/材料質(zhì)量比為3 :1 ;泳道8為質(zhì)粒DNA ;泳道9為DNA marker。
[0042] 圖8是聚乙烯亞胺與改性聚乙烯亞胺的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析圖，其中，（a):濃度分 另Ij 為 〇 μ g/200 μ L，0· 25 μ g/200 μ L，1 μ g/200 μ L，4 μ g/200 μ L，16 μ g/200 μ L 的聚乙烯 亞胺的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析；(b):濃度分別為0 μ g/200 μ L，0. 25 μ g/200 μ L，1 μ g/200 μ L